氧化應激對卵母細胞發育及體外受精-胚胎移植結局的影響

歐陽小娥，胡蓉

?

·綜述·

氧化應激對卵母細胞發育及體外受精-胚胎移植結局的影響

歐陽小娥，胡蓉△

卵母細胞及胚胎發育的微環境中，由氧氣參與新陳代謝所產生的一些活性氧物質如得不到及時清除，會誘導氧化應激的現象。有研究顯示，氧化應激是影響卵母細胞質量和胚胎發育潛能的主要因素之一，大量的氧化應激可導致卵母細胞內線粒體形態和功能的改變，進而影響三磷酸腺苷（ATP）合成，干擾卵母細胞內減數分裂，使卵母細胞內非整倍體染色體數目增多，造成胚胎DNA損傷和早期發育停滯，最終導致不良妊娠結局。在體外培養時，經常通過添加外源性抗氧化劑或自由基清除劑，以及建立并維持卵母細胞及胚胎發育所需的低氧環境來拮抗氧化應激的不良作用。就氧化應激的產生、對卵母細胞和胚胎發育的影響及其機制，以及如何拮抗氧化應激的不良影響進行綜述。

活性氧；氧化性應激；卵母細胞；受精，體外；胚胎移植；妊娠結局

【Abstract】Some of reactive oxygen species（ROS）were produced in themicroenvironment of oocyte and embryo when oxygen participates in the metabolism.If not eliminated in time，ROS can directly induce the oxidative stress.Studies have shown that the oxidative stress is one of the dominant factors related to the oocyte quality.The excess oxidative stressmay lead to changes in the morphology and function ofmitochondria in the oocyte，the synthesis of ATP and themeiotic process.After that，the increasing oocyte aneuploidy and the damage of embryonic DNA may lead to the stagnation of embryonic development and the poor outcome of pregnancy.In in vitro culture of oocyte and embryo，the adverse effects of oxidative stress can be well eliminated by adding exogenous antioxidants or free radical scavenger，and establishing and maintaining the hypoxic environment for the development of oocyte and embryo.This article reviewes the onset of oxidative stress，the effect on the development of oocytes and embryo and the mechanisms involved，and how to overcome the adverse affect of oxidative stress.

【Keywords】Reactive oxygen species；Oxidative stress；Oocytes；Fertilization in vitro；Embryo transfer；Pregnancyoutcome

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：299-302，312）

隨著自由基理論的建立和發展，研究發現氧的某些代謝產物及其衍生物可以損傷機體，這些物質具有比氧更為活潑的化學性質，統稱為活性氧（ROS）。ROS分為3種類型：超氧自由基（O2-）、羥基（OH-）和過氧化氫（H2O2）。正常卵及胚胎發育需要身體內外環境因素的共同調節，當發生調節失衡可導致卵母細胞及胚胎發育異常，從而影響妊娠結局。過去近20年中對卵母細胞及胚胎發育的研究，主要局限在卵泡內細胞因子的調節和卵泡池的老化等指標。而隨著分子生物學技術的發展，對氧化應激的研究已日趨完善。此外，隨著體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術的進一歩發展應用，輔助生殖技術已成為治療不孕癥的最有效辦法之一，其使命是盡最大限度地以最小的干預為患者提供最高的單胎活產率。本文旨在探討如何在卵母細胞和胚胎發育早期采取非侵入性的手段建立并維護卵母細胞和胚胎發育所需適合的微環境，進一步選擇具有較強發育潛能的胚胎進行移植，從而獲得更好的妊娠結局。

基金項目：國家自然科學基金（81260109）；2014年寧夏醫科大學總醫院特殊人才啟動項目（XT201421）

作者單位：750004銀川，寧夏醫科大學（歐陽小娥）；寧夏醫科大學總醫院生殖中心（歐陽小娥，胡蓉）

通信作者：胡蓉，E-mail:hr7424@126.com

△

審校者

1　氧化應激現象的產生

在IVF-ET中，卵母細胞和胚胎中ROS的產生主要有兩個來源：一個是內源性由配子和胚胎自身代謝直接產生，如：氧化磷酸化過程和細胞凋亡；另一個是由周圍環境即外源性因素造成，如：氧氣濃度、吸煙、年齡和生育力低下［1］。此外有研究報道，當用限制應激、熱應激分別干預卵母細胞和胚胎的成熟培養體系時，發現其也能誘導體系中氧化應激的產生。胚胎在體內發育與體外培養過程中的最大差異是周圍環境中氧氣濃度不同，所以正常生理條件下ROS在體內不斷產生和被清除，使ROS濃度處于平衡狀態；但體外發育的胚胎，一方面細胞氧化代謝的產物得不到及時清除，另一方面體外培養環境進一步誘發氧化應激，導致ROS蓄積，濃度升高，對卵母細胞和胚胎的發育產生毒性作用［2］。

2　氧化應激對卵母細胞發育的影響

卵母細胞發育過程中，一些因素如外周氧濃度升高，自由基清除劑缺乏［3］，制動應激和抗氧化酶含量降低，可通過某些途徑造成卵細胞線粒體的損傷、三磷酸腺苷（ATP）缺乏、減數分裂異常和非整倍體染色體數目增加，進而損害卵母細胞及胚胎發育潛能。

2.1ROS對卵母細胞結構及生化反應的影響大量研究表明，過量ROS是造成脫氧核糖核酸（DNA）損傷的主要因素，因為ROS含量比較高，使得線粒體處于高氧化應激環境，由于缺乏DNA修復應急機制，使得線粒體脫氧核糖核酸（mtDNA）突變率增加［4］。Esta?等［5］發現，三氧化二砷（As2O3）能導致ROS含量升高，造成線粒體中大量堿基被刪除，使得mtDNA的復制數量明顯減少。當用N-乙酰半胱氨酸處理后，能有效清除由As2O3誘導產生的ROS，減輕mtDNA受損的嚴重程度，增加培養基中卵母細胞內ATP含量。Burruel等［2］發現ROS的過度升高引起卵母細胞減數分裂停滯，繼而發生凋亡，對卵母細胞成熟和后續胚胎發育造成不良影響。另有研究表明，超氧化物歧化酶（SOD）基因敲除后，誘導氧化應激使得孕酮分泌下降，進一步導致不孕和不良妊娠結局［6］。

2.2ROS介導制動應激對卵母細胞的損傷有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是卵母細胞成熟過程中對紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）蛋白的表達和維持起關鍵作用的調控因子。研究發現孕婦受制動應激處理后，通過誘導卵母細胞內的氧化應激，降低MAPK的活性，進而干擾紡錘體組裝和SAC的功能，且加快第1次減數分裂后期的進程，導致姊妹染色單體不分離和卵母細胞內非整倍體染色體數目增加［7］。另外，Lian等［7］研究制動應激大鼠模型，提出制動應激對卵母細胞發育的影響可能是因為氧化應激的產生而導致的。Zhou等［8］發現制動應激處理孕早期小鼠，子宮局部抗氧化相關酶的含量顯著降低，而氧化產物的含量則顯著增加，提示制動應激通過擾亂孕早期子宮局部的氧化應激平衡，誘導氧化應激的產生，進一步影響卵母細胞和胚胎的發育。

2.3ROS介導熱應激對卵母細胞和胚胎發育的損傷目前已知熱應激在實際生產中對家畜繁殖有影響，其不僅可通過影響母體輸卵管和子宮環境影響卵母細胞和胚胎發育，還可直接影響受精后胚胎質量。Roth等［9］用流式細胞儀檢測卵母細胞凋亡率時發現，40℃和41℃熱應激組卵母細胞凋亡率高于38.5℃組，提示卵母細胞成熟期間熱應激能誘導其凋亡，進而導致卵母細胞受精后早期胚胎發育潛能降低。另有學者通過研究熱應激對機體以及生殖系統氧化、卵母細胞和植入前胚胎氧化及發育能力的影響，發現隨著熱應激溫度升高和時間延長，肝臟和輸卵管中總谷胱甘肽含量降低；當溫度達到41℃時，卵巢和子宮中總谷胱甘肽降低，提示熱應激誘導氧化應激的產生，進而啟動抗氧化應激防御機制。已有研究證實，熱應激能使胚胎內過氧化氫含量升高，抗氧化劑谷胱甘肽含量降低。在培養液中添加抗氧化劑可增強胚胎對熱應激的耐受性，而抑制胚胎谷胱甘肽的合成會導致胚胎對熱應激的耐受性降低。Zhang等［10］發現，相比未經熱應激干預的對照組，實驗組中受熱應激處理后，大腸桿菌的代謝活性下降，ROS水平提高，乳酸脫氫酶活性和ATP水平降低。而生物技術合成的金納米粒子通過增加谷胱甘肽、SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）的合成有效緩解熱應激誘導的氧化應激不良反應。熱休克蛋白（HSP）是胚胎對熱應激做出保護性應答反應的主要產物之一，Zhu等［11］研究產婦飲食中補充錳元素能否克服熱應激對胚胎發育的不良影響，通過觀察比較常溫和高溫下胚胎的孵育率、抗氧化狀態和HSP的表達水平，發現熱應激能誘導氧化應激產生，使胚胎死亡率增加。補充錳增強胚胎抗氧化能力，克服熱應激誘導氧化應激的不良效應，改善胚胎發育潛能。

3氧化應激對IVF-ET結局的影響

氧化應激是導致不孕及影響IVF-ET成功率的重要因素，其一方面可通過干擾卵母細胞的減數分裂［2］，誘導卵母細胞的退化和凋亡；另一方面通過產生過氧化物，造成胚胎DNA損傷和基因突變［3］。有學者發現，當減少抗氧化維生素，如維生素A、E、C等的補充時，機體抗氧化水平降低，且由于氧自由基產生增加造成胚胎DNA損傷，以及胚胎DNA損傷修復功能紊亂和缺陷［12］。有學者研究發現小鼠精子在80℃熱水浴后，由于熱應激誘導氧化應激產生，破壞了精子染色質的完整性，導致精子DNA去甲基化和組蛋白去甲基化過程失敗，進而影響后續胚胎發育。

有研究表明，高氧環境下易產生更多的ROS導致胚胎DNA斷裂、線粒體改變及蛋白氧化修飾等，從而影響受精和胚胎發育，導致不良妊娠結局［13］。Forristal等［14］通過對人類胚胎干細胞研究發現，低氧環境更利于維持人類胚胎干細胞的增殖和多能性。另有學者探究牛精子DNA碎片和氧化應激對早期胚胎體外發育結局的影響，實驗分組按氧化應激強度大小依次為低、中、高、最高氧化應激組，之后檢測各組中精子DNA的完整性和胚胎卵裂率，結果發現：隨氧化應激強度增大，精子DNA完整性逐漸缺失，胚胎卵裂率逐漸下降，提示氧化應激能損害精子DNA完整性，進而損害胚胎質量，影響早期胚胎體外發育［15］。

4氧化應激對卵母細胞及胚胎發育造成危害的潛在機制

核因子κB（NF-κB）是一個由復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，其作為信號傳導途徑中的樞紐，是氧化應激與子宮內膜細胞發育的橋梁，調控細胞凋亡及胚胎發育［16］。研究發現氧化應激產生的過量ROS，作為第二信使通過調節磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2），激活NF-κB信號通路誘導炎癥和凋亡［17］。ROS可通過激活應激相關激酶如ERK1/2、應激激活的蛋白激酶（JNK）和p38，刺激NF-κB，誘導促炎因子的釋放，也可以直接降解NF-κB抑制因子（IκB），激活NF-κB進入細胞核，與DNA控制元件結合最終導致DNA的斷裂［17］。此外，NF-κB也可以調節抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶-1的基因，促進ROS的產生［6］。

沉默信息調節蛋白1（Sirt1）屬于煙堿腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，參與組蛋白和非組蛋白賴氨酸殘基的去乙酰化，通過對p53、叉形頭轉錄因子O亞型（FOXO）等進行去乙酰化作用，調控氧化應激、基因轉錄、衰老等系列過程。Hou等［18］采用Sirt1抑制劑EX-527證實內皮細胞經氧剝奪處理后，促紅細胞生成素通過提高Sirt1蛋白表達而升高蛋白激酶（Akt）活性，并促進FOXO表達，同時還通過防止線粒體去極化，減少細胞色素C等活化線粒體途徑降低氧化應激水平進而保護細胞。另有研究表明Sirt1通過FOXO的脫乙酰化作用，能刺激CAT和錳SOD（manganese-containingsuperoxide dismutase，MnSOD）的表達，從而避免氧自由基對細胞的損傷，保證卵母細胞減數分裂過程的正常進行［19］。

5　IVF-ET過程中如何拮抗氧化應激的不良作用

體外培養的胚胎發生發育阻滯的原因之一是環境氧濃度升高引起ROS蓄積，因為體外環境相比體內環境相對缺乏自由基清除劑。研究表明在IVFET過程中可以從兩方面拮抗氧化應激的不良作用，一方面是機體自身抗氧化系統對氧化應激現象的拮抗作用，另一方面是在小鼠胚胎體外培養中加入外源性自由基清除劑如褪黑素、羧乙基鍺倍半氧化物（Ge-132）和半胱氨酸等物質或建立并維持低氧環境（5%O2）。

5.1機體自身抗氧化系統對氧化應激現象的拮抗作用哺乳動物卵母細胞和胚胎內部存在多種抗ROS機制，主要分為非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物。非酶性抗氧化物主要包括維生素A、維生素C、維生素E、谷胱甘肽、半胱氨酸等。酶性抗氧化物包括SOD、CAT、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）和過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin，PRDX）等，其能夠加速超氧陰離子轉變成過氧化氫，抑制電子傳遞到金屬離子，避免形成羥基自由基。

5.2添加褪黑素對氧化應激現象的拮抗作用有研究表明褪黑素是一種高效的自由基清除劑，具有抗氧化作用，能夠減少ROS損傷，提高豬孤雌胚胎體外發育的囊胚形成率、囊胚細胞數及減少細胞凋亡［20］。褪黑素對胚胎發育的促進作用部分歸因于其能上調抗凋亡基因如B細胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcl-2）的表達，和下調促凋亡基因如Bcl-2相關X蛋白基因（BAX）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （caspase-3），同時提高細胞內的谷胱甘肽水平及降低ROS水平［21］，這些作用可降低囊胚凋亡水平，提高胚胎質量及種植率。

5.3添加Ge-132對氧化應激現象的拮抗作用Ge-132

是有機鍺化合物，具有抗氧化效應和抗癌效應。有學者發現，相比未添加Ge-132的對照組，實驗組用

200μg/mLGe-132處理體外成熟卵母細胞后，胞內還原型谷胱甘肽（GSH）水平顯著增加（P＜0.05），ROS含量顯著下降，抗氧化相關基因——核轉錄因子2（Nrf-2）的信使RNA（mRNA）表達水平增高，凋亡基因Bax的mRNA表達水平降低［22］。

5.4添加半胱氨酸對氧化應激現象的拮抗作用半胱氨酸是一種還原劑，具有抗氧化抗衰老的作用，對卵母細胞的發育有一定的保護作用。研究發現，向卵母細胞體外成熟培養基中添加半胱氨酸可以降低ROS水平和減少非整倍體染色體，同時增加谷胱甘肽的合成和改善植入前后胚胎的發育［8］。Deleuze等［23］研究半胱氨酸對體外培養馬卵母細胞成熟的作用發現，相比未添加半胱氨酸組，添加半胱氨酸組中卵母細胞原核形成率、卵裂率均表現出明顯增高，胚胎發育情況也有明顯改善。另有研究發現低溫下添加抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸能降低氧化應激誘導的卵母細胞凋亡程度，進而阻止或延緩排卵后卵母細胞老化［24］。

5.5建立并維持低氧環境（5%O2）減少ROS的產生除添加抗氧化劑來減弱或消除氧化應激外，減少ROS的生成也是一種有效的方式，即從源頭上拮抗氧化應激的不良作用。超氧陰離子來源于氧分子，所以降低培養環境中的氧濃度，能減少ROS的生成，從而減少氧化應激造成的氧化損傷。已有研究表明：相比5%O2，20%O2能加速培養液中ROS形成，誘導組蛋白修飾，使酶失活，膜脂過氧化，進而損傷胚胎膜表面，影響胚胎及胎兒發育［25］。Favetta等［26］將胚胎分別置于20%和5%的氧濃度下培養發現，前者細胞內H2O2濃度比后者增加了10倍，而在2-4細胞期胚胎發育停滯的發生率增長了2倍，提示建立并維持胚胎發育的低氧環境，可以降低外源性ROS的產生，提高胚胎發育潛能，提高妊娠率，改善輔助生殖結局。

6結語

目前已明確了可能導致氧化應激現象產生的原因以及氧化應激對卵母細胞和胚胎發育的不良作用。這些不良作用包括通過損害線粒體功能，影響ATP合成；干擾脂質代謝，影響脂蛋白水平；造成蛋白酶損傷，影響代謝活動。而這一系列不良作用是通過更具體的分子機制、信號轉導通路，還是直接影響卵母細胞成熟、減數分裂、受精和胚胎發育，仍有待進一步證實。盡管在基因、代謝和生殖領域已開展了大量研究探討與卵巢功能異常有關的病因學和病理學機制。但是，要闡明與卵母細胞發育潛能和IVF-ET結局相關的分子學及遺傳學作用機制仍是一項巨大的挑戰。今后應對卵母細胞及胚胎發育微環境中氧化應激進行更深入研究，明確拮抗氧化應激、提高胚胎質量的可行性及潛在機制，為進一步優化卵母細胞成熟培養體系提供理論依據，為加強人類輔助生殖技術的應用提供理論依據。

［1］Aitken RJ，Smith TB，Jobling MS，et al.Oxidative stress and male reproductivehealth［J］.Asian JAndrol，2014，16（1）：31-38.

［2］Burruel V，Klooster K，Barker CM，et al.Abnormal early cleavage events predict early embryo demise:sperm oxidative stress and early abnormalcleavage［J］.SciRep，2014，4：6598.

［3］Ou XH，Li S，Wang ZB，et al.Maternal insulin resistance causes oxidative stressandmitochondrial dysfunction inmouse oocytes［J］. Hum Reprod，2012，27（7）：2130-2145.

［4］Gundala SR，Yang C，MukkavilliR，etal.Hydroxychavicol，a betel leaf component，inhibits prostate cancer through ROS-driven DNA damageand apoptosis［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2014，280（1）：86-96.

［5］Esta?MC，Calvi?o E，Calvo S，et al.Apoptotic efficacy of etomoxir in human acutemyeloid leukemia cells.Cooperation with arsenic trioxide and glycolytic inhibitors，and regulation by oxidative stress and protein kinaseactivities［J］.PLoSOne，2014，9（12）：e115250.

［6］Bakunina N，Pariante CM，Zunszain PA.Immune mechanisms linked to depression via oxidative stress and neuroprogression［J］. Immunology，2015.［Epub ahead ofprint］.

［7］Lian HY，Gao Y，Jiao GZ，et al.Antioxidant supplementation overcomes the deleterious effects ofmaternal restraint stress-induced oxidative stressonmouse oocytes［J］.Reproduction，2013，146（6）：559-568.

［8］Zhou P，Lian HY，CuiW，etal.Maternal-restraint stress increases oocyte aneuploidy by impairingmetaphase Ispindle assembly and reducing spindle assembly checkpoint proteins in mice［J］.Biol Reprod，2012，86（3）：83.

［9］Roth I，Hansen PJ.Involvement of apoptosis in disruption of developmental competence ofbovineoocytesby heart shock during maturation［J］.BiolReprod，2004，71（6）：1898-1906.

［10］Zhang XF，Shen W，Gurunathan S，et al.Biologically Synthesized Gold Nanoparticles Ameliorate Cold and Heat Stress-Induced Oxidative Stress in Escherichia coli［J］.Molecules，2016，21（6）. pii：E731.

［11］Zhu YW，Lu L，LiWX，etal.Effectsofmaternaldietarymanganese and incubation temperature on hatchability，antioxidantstatus，and expression ofheatshock proteins in chick embryos［J］.JAnim Sci，2015，93（12）：5725-5734.

［12］Carbillon L.Cell-free fetal DNA fragments and preeclampsia［J］. Chem Biol Interact，2014，218：10-11.

［13］Gawecka JE，Marh J，Ortega M，et al.Mouse zygotes respond to severe sperm DNA damage by delaying paternal DNA replication and embryonic development［J］.PLoSOne，2013，8（2）：e56385.

［14］Forristal CE，Christensen DR，Chinnery FE，et al.Environmental oxygen tension regulates theenergymetabolism and self-renewalof human embryonic stem cells［J］.PLoSOne，2013，8（5）：e62507.

［15］Sim?es R，Feitosa WB，Siqueira AF，et al.Influence of bovine sperm DNA fragmentation and oxidative stress on early embryo in vitro development outcome［J］.Reproduction，2013，146（5）：433-441.

［16］Cui XB，Guo X，Chen SY.Response gene to complement 32 deficiency causes impaired placental angiogenesis in mice［J］. Cardiovasc Res，2013，99（4）：632-639.

［17］Zha L，Chen J，Sun S，et al.Soyasaponins can blunt inflammation by inhibiting the reactive oxygen species-mediated activation of PI3K/Akt/NF-kB pathway［J］.PLoSOne，2014，9（9）：e107655.

［18］Hou J，Wang S，Shang YC，et al.Erythropoietin employs cell longevity pathwaysof SIRT1 to foster endothelial vascular integrity during oxidant stress［J］.Curr Neurovasc Res，2011，8（3）：220-235.

［19］Di Emidio G，Falone S，Vitti M，et al.SIRT1 signalling protects mouse oocytes against oxidative stress and is deregulated during aging［J］.Hum Reprod，2014，29（9）：2006-2017.

［20］Maitra SK，Hasan KN.The Role ofMelatonin asa Hormone and an Antioxidant in the Control of Fish Reproduction［J］.Front Endocrinol（Lausanne），2016，7：38.

［21］Pang YW，Sun YQ，Sun WJ，et al.Melatonin inhibits paraquatinduced cell death in bovine preimplantation embryos［J］.JPineal Res，2016，60（2）：155-166.

［22］Kim E，Jeon Y，Kim DY，et al.Antioxidative effect of carboxyethylgermanium sesquioxide（Ge-132）on IVM ofporcine oocytes and subsequent embryonic development after parthenogenetic activation and IVF［J］.Theriogenology，2015，84 （2）：226-236.

［23］Deleuze S，Goudet G.Cysteamine supplementation of in vitro maturationmedia:a review［J］.Reprod DomestAnim，2010，45（6）：e476-e482.

［24］Li Q，Cui LB.Combined inhibitory effects of low temperature and N-acetyl-l-cysteineon thepostovulatory agingofmouseoocytes［J］. Zygote，2016，24（2）：195-205.

［25］Gaspar RC，Arnold DR，Corrêa CA，et al.Oxygen tension affects histone remodeling of in vitro-produced embryos in abovinemodel ［J］.Theriogenology，2015，83（9）：1408-1415.

［26］Favetta LA，St John EJ，KingWA，et al.High levels of p66shc and intracellular ROS in permanently arrested early embryos［J］.Free Radic BiolMed，2007，42（8）：1201-1210.

［本文編輯秦娟］

Effects of Oxidative Stress on Oocyte Development and the Outcome of in vitro Fertilization-Embryo Transfer:A Review

OUYANG Xiao-e，HU Rong.Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China （OUYANG Xiao-e）；Reproductive Medicine Center，The General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China（OUYANG Xiao-e，HU Rong）

HU Rong，E-mail:hr7424@126.com

·綜述·

（2016-03-18）