TM6SF2 rs58542926 E167K單核苷酸多態性與非酒精性脂肪性肝病易感性的關系

張 爽，李異玲

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，遼寧 沈陽 110001

專題·非酒精性脂肪性肝病

TM6SF2 rs58542926 E167K單核苷酸多態性與非酒精性脂肪性肝病易感性的關系

張 爽，李異玲

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，遼寧 沈陽 110001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見疾病，目前除了肥胖、高脂血癥、糖尿病及胰島素抵抗等危險因素外，遺傳因素在其發病中起到的作用越來越受到重視。近期發現的TM6SF2 rs58542926 E167K單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與NAFLD的易感性明顯相關，且有研究顯示其與非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化及肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發生同樣相關。目前認為TM6SF2在體內參與肝細胞脂肪代謝，與極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)的分泌有關，TM6SF2 rs58542926 E167K突變導致該蛋白功能喪失，引起肝臟甘油三酯(triglyceride,TG)的過度積累，導致NAFLD的發生。

非酒精性脂肪性肝病；TM6SF2 rs58542926 E167K；單核苷酸多態性；易感性

目前認為非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發病與肥胖、高脂血癥、糖尿病及胰島素抵抗有關，有研究[1]認為，NAFLD是全身代謝綜合征在肝臟的一種表現。NAFLD的典型病理表現為肝臟中過量甘油三酯(triglyceride,TG)蓄積，并出現脂滴。但是肝臟TG的聚集在不同個體間有明顯差異，且NAFLD的發病具有明顯的家族聚集性[2]，有研究[3]顯示脂肪肝的遺傳概率為26%～27%，人們開始重視遺傳因素在此過程中的作用。隨著全基因組關聯分析(genome-wide association studies，GWAS)在疾病研究中的應用，人們意識到NAFLD與肥胖、高血壓病、2型糖尿病、心血管疾病等一樣，是由危險因素(肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗等)與易感基因相互作用并最終導致疾病的發生[4]。遺傳因素不僅影響個體對疾病的易感性，且可能影響其疾病的發展及預后。

1 NAFLD相關GWAS研究最新進展

2008年Romeo等[5]首次通過GWAS方法，在9 229名不同人種的參與者中發現PNPLA3 rs738409單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與NAFLD的易感性有極大相關性，隨后的研究[6-8]證明，PNPLA3 rs738409 I148M SNP不僅影響NAFLD的易感性，且對NAFLD是否進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌產生顯著影響。此后相繼報道的可能影響NAFLD易感性的基因包括：NCAN、PPP1R3B、GCKR、LYPLAL1、CDKN1A等[8-11]。

2014年Kozlitina等[12]首次報道了TM6SF2(transmembrane 6 superfamily member 2)rs58542926 E167K SNP與NAFLD易感性的相關性。他們通過GWAS方法，在驗證了PNPLA3 rs738409 I148M SNP與NAFLD易感性相關的基礎上，在TM6SF2基因上找到與NAFLD易感性相關的新的SNP：TM6SF2 rs58542926 E167K，隨著對TM6SF2基因研究的逐漸深入，TM6SF2 rs58542926 E167K SNP與NAFLD發生、發展的相關性逐漸受到人們的重視。

2 TM6SF2的一般特性

TM6SF2于2000年首次被報道[13]。TM6SF2位于第19號染色體上，編碼一段由351個氨基酸構成的蛋白，據估計其蛋白結構是由7個跨膜功能域組成的，但均與目前已發現的具有功能的功能域不同。TM6SF2主要在腦組織、腎臟、肝臟及小腸表達，其中在小腸組織表達最高[12]。與TM6SF2基因連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)程度很高的NCAN基因被報道與脂肪代謝有關[14]。

TM6SF2 rs58542926 E167K SNP在歐洲人種中次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)最高(7.2%)，高于非裔美國人(3.4%)及西班牙人(4.7%)[12]，在中國香港人中攜帶率為7.0%[15]，與在中國大陸人群中的攜帶率(6.6%)相當[16]。

TM6SF2上的rs58542926 SNP導致第499號核苷酸由胞嘧啶(cytosine，C)突變為胸腺嘧啶(thymine，T)的替代突變導致第167殘基由谷氨酸突變為賴氨酸(rs58542926 c.499 C>T，p.Glu167Lys，E167K)，進而影響由其編碼的蛋白質的功能[17]。在HuH-7肝癌細胞中分別表達TM6SF2的野生型(167E)及突變型(167K)后發現，野生型及突變型的TM6SF2 mRNA的表達數量是相當的，但突變型TM6SF2蛋白量僅是野生型TM6SF2蛋白量的46%。由此猜測，TM6SF2突變型蛋白由于表達異常導致在細胞內加速降解，進而導致突變型蛋白量的減少[12]。

3 TM6SF2 rs58542926 E167K與血脂異常的關系

Kozlitina等[12]通過達拉斯心臟研究(Dallas Heart Study，DHS)，檢測了2 763名參與者的138 374個序列與肝臟TG含量的關系，發現TM6SF2 rs58542926 T等位基因攜帶率與肝臟TG含量顯著相關，還發現TM6SF2 rs58542926 E167K突變與血漿TG、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)水平的下降有關，與血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)水平無關。

為了驗證這一結果，Kozlitina等[12]利用導入腺病毒載體特異地降低小鼠肝臟TM6SF2基因轉錄的方法，研究TM6SF2基因在肝臟脂肪代謝中的作用，結果發現小鼠體內肝臟TG含量升高了3倍，血漿膽固醇水平顯著下降，血漿TG水平也呈下降趨勢；而TM6SF2 167E基因過表達，肝臟TG含量顯著下降，血漿LDL-C含量升高。敲除TM6SF2 167E基因后產生的肝臟TG含量升高及血漿膽固醇、及TG含量降低的結果，是否說明TM6SF2 167E基因在體內有參與分泌極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)的功能呢？為了驗證這一猜想，Kozlitina等[12]抑制血管內脂蛋白酶活性并檢測血漿中VLDL累積的速率，結果發現TM6SF2 167E基因敲除小鼠體內VLDL累積速率顯著降低。由此得出結論，TM6SF2 167E基因在體內的確參與VLDL分泌，而TM6SF2 167K導致的肝臟TG含量升高與TM6SF2蛋白功能喪失有關。

Holmen等[18]在C57BL/6J小鼠體內進行Northern blotting及Western blotting檢測發現，內源性TM6SF2 mRNA及蛋白在小鼠肝臟高度表達。通過在C57BL/6J小鼠體內使TM6SF2基因過表達，觀察到血漿總膽固醇(TC)、LDL-C及TG水平均有所升高(TC：2.3倍，P=9×10-4；LDL-C：5.8倍，P=4×10-4;TG：1.13倍，P=0.031)，而HDL-C水平則有所下降(0.45倍，P=9×10-4)；而敲除TM6SF2基因則引起血漿TC較正常對照降低了18.2%(P=0.013)，因此考慮TM6SF2基因的功能與血脂水平調節有關，更具體地說，TM6SF2基因變異可能會引起肝臟脂蛋白水平升高，這與Kozlitina等[12]的實驗結果一致。

Mahdessian等[19]利用共聚焦顯微鏡進行亞細胞定位，觀察到TM6SF2蛋白定位于肝細胞的內質網(endoplasmic reticulum，ER)及ER與高爾基體的間隔(the ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)上，并利用在Huh7、HepG2肝癌細胞中過表達、敲除TM6SF2基因的方法，比較其表達水平變化產生的生物學效應。結果表明，敲除TM6SF2基因可導致甘油三酯脂蛋白(TG-rich lipoproteins，TRLs)的分泌減少，使血漿中TG濃度降低，肝細胞TG含量升高，肝臟脂滴大小及數量增加，與之相對，TM6SF2基因過表達可導致TRLs分泌增加，使血漿中TG濃度升高，肝細胞TG含量降低，脂滴大小及數量減少。據此推測TM6SF2基因與肝細胞低密度脂蛋白及TG的分泌有關，TM6SF2基因突變引起分泌功能下降，導致肝臟脂蛋白蓄積增加。且實驗結果與Kozlitina等[12]及Holmen等[18]相一致。

4 TM6SF2 rs58542926 E167K與肝酶異常的關系

TM6SF2 rs58542926 E167K突變(EK/KK)可引起血漿丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)含量顯著升高(P=0.003)，突變純合子(KK)有引起血漿天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)升高的趨勢[12]，這點與PNPLA3 I148M相似，PNPLA3 I148M可引起肝臟TG含量及ALT顯著升高[3]，且PNPLA3 I148M是目前被證明與NAFLD易感性相關的唯一突變，并與NAFLD的進展有關。

TM6SF2 E167K并未觀察到與谷氨酰轉肽酶(gamma glutamyl transpeptidase，GGT)有明顯關聯，但可以引起血漿堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)顯著下降。TM6SF2基因在人體小腸組織中表達最高，小腸從食物中吸收TG蛋白，即乳糜微粒，ALP同樣在小腸表達。TM6SF2 E167K引起血漿ALP下降，這可能與小腸組織中TM6SF2 E167K突變有關[12]。Kaliannan等[20]發現清除小鼠小腸內ALP后可以誘導小鼠產生代謝綜合征。TM6SF2 E167K是否可以通過引起ALP下降從而影響脂肪代謝、進而增加肝臟TG含量、影響NAFLD的發生仍有待進一步研究。

5 TM6SF2 E167K與NAFLD的關系

Liu等[17]在349例NAFLD患者中檢測到TM6SF2 E167K的MAF為0.12，顯著高于由265名白人組成的正常對照組(MAF=0.07)及北歐人群正常對照組(MAF=0.07)，且在由NAFLD的患者組成的實驗組(n=349)和驗證組(n=725)中發現TM6SF2 E167K等位基因的攜帶數量與NAFLD發病率相關(P=0.0008)。

Sookoian等[21]在226例NAFLD患者組成的實驗組及135名正常參與者組成的對照組中檢測發現，對照組中C(Glu167)等位基因及T(Lys167)等位基因攜帶率分別為94.5%、5.5%，而所有參與者的C(Glu167)、T(Lys167)攜帶率分別為91.4%、8.6%。通過離散性狀分析(discrete trait analysis)發現，TM6SF2 E167K與NAFLD的發病相關(P=0.038，OR=1.37，95%CI：1.02～1.84)。

Wong等[15]通過分別檢測384例NAFLD患者及384名正常人中TM6SF2 167K的攜帶率，發現TM6SF2 167K突變與NAFLD易感性明顯相關(P=0.0007)，從而證明在中國漢族人口中，TM6SF2 rs58542926 E167K SNP與NAFLD的易感性同樣相關。Pirola等[22]通過Meta分析發現TM6SF2 rs58542926 E167K與NAFLD的發生相關。

6 TM6SF2 E167K與脂肪變性的關系

Liu等[17]在349例NAFLD患者組成的實驗組中，比較TM6SF2 E167K對肝臟細胞脂肪變性的影響，發現TM6SF2 E167K與肝細胞脂肪變性的程度無明顯關系(β=0.087±0.083，95%CI：0.076～0.025，P=0.296)，在該研究中由725例NAFLD患者組成的驗證組中得到了同樣的結論。但將實驗組和驗證組合并后(n=1 074)，TM6SF2 E167K與肝細胞脂肪變性顯示出有關聯的趨勢(β=0.111±0.059，95%CI：0.0041～0.2268，P=0.554)，尤其是將肝細胞脂肪變性的程度按照輕度(S0-1)及重度(S2-3)進行分組后，這種影響變得更加明顯(OR=1.379，95%CI：1.019～1.865，P=0.037)，由此得出結論，攜帶TM6SF2 E167K等位基因與肝細胞脂肪變性的嚴重程度可能相關。Sookoian等[21]的研究得出與Liu等[17]一致的結論，攜帶TM6SF2的T等位基因(EK/KK)與肝細胞脂肪變性明顯相關(β=0.15，P=0.0299)。

7 TM6SF2 E167K與非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的關系

Liu等[17]通過綜合分析肝臟組織學壞死性炎癥及肝細胞氣球樣變性的情況研究TM6SF2 E167K與NASH的關系，與性別、年齡、體質量指數(body mass index，BMI)、2型糖尿病、PNPLA3 rs738409等因素通過多變量分析發現實驗組TM6SF2 E167K與NASH的嚴重程度有關(β=0.288±0.139，95%CI：0.015～0.561，P=0.039)。

然而Sookoian等[21]通過比較由NASH組成的實驗組與NAFLD組成的對照組發現，攜帶T等位基因(EK/KK)并未對是否進展為NASH產生顯著影響(OR=1.13，95%CI：0.58～2.20)，同時也未觀察到攜帶T等位基因(EK/KK)與小葉炎癥(OR=0.85，95%CI：0.60～1.20，P=0.34)或肝細胞氣球樣變性(OR=1.08，95%CI：0.78～1.50，P=0.64)有關聯。TM6SF2 E167K是否與NASH具有相關性仍有待進一步研究。

8 TM6SF2 E167K與肝纖維化的關系

Liu等[17]通過分別檢測均由NAFLD患者組成的實驗組(n=349)、驗證組(n=725)、混合組(n=1 074)中TM6SF2 E167K的攜帶率發現，T危險基因與肝纖維化的程度有關，且是獨立于性別、年齡、BMI、2型糖尿病及PNPLA3 rs738409以外的危險因素，且攜帶T危險基因的數量與肝纖維化程度明顯相關。

Dongiovanni等[23]在1 201例懷疑有NASH歐洲NAFLD患者中檢測有188名TM6SF2 E167K攜帶者，該攜帶者表現出更嚴重的肝損傷，包括脂肪變性、壞死性炎癥、氣球樣變，且更易進展為肝纖維化(OR=2.08)。

9 TM6SF2與肝細胞癌的關系

Liu等[17]通過檢測99例NAFLD發展的肝細胞癌患者的TM6SF2 E167K的攜帶率，并與由1 074例NAFLD患者組成的對照組中TM6SF2 E167K的攜帶率比較，發現T危險基因顯著影響NAFLD導致的肝細胞癌的發病率(OR=1.922，95%CI：1.31～2.81，P=6.81×10-4)，但當與年齡、性別、BMI、2型糖尿病及是否患肝硬化等因素進行多變量分析時，這種影響便消失了(P=0.42)，這種結果考慮與這個研究中肝細胞癌患者數量過少有關。因此，TM6SF2 E167K是否與NAFLD→肝細胞癌的發生率有關仍需進一步的研究。

TM6SF2在人體內的生物功能雖仍未被闡明，但目前普遍認為該基因表達的蛋白參與肝臟脂質代謝，TM6SF2 E167K突變將引起該蛋白功能喪失，引起肝臟TG含量增加、血漿膽固醇含量降低，進而導致NAFLD的發生，另一方面，由于引起血漿LDL含量降低對心血管疾病的發生起到保護作用[23]。有關TM6SF2 E167K突變引起肝臟脂肪代謝異常的分子機制仍需深入研究。

TM6SF2 E167K是否與PNPLA3 I148M一樣，不僅影響NAFLD的易感性，且影響NASH、肝細胞癌的發生目前還沒有定論，仍需要更為深入的研究。且目前有研究[24]發現PNPLA3 I148M是導致肝硬化及肝細胞癌發生的獨立危險因素，TM6SF2 E167K是否具有同樣的作用有待進一步研究。我國關于TM6SF2 E167K的研究目前仍不夠深入，TM6SF2 E167K在我國人群中的攜帶率及是否與NASH、肝硬化及肝細胞癌的發生相關等問題仍需進一步研究。

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(責任編輯：王全楚)

The relationship between TM6SF2 rs58542926 E167K single nucleotide polymorphisms and the susceptibility of non-alcoholic fatty liver disease

ZHANG Shuang,LI Yiling

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a common disease,which is absolutely associated with features of the metabolic syndrome,including obesity,dyslipidaemia,type 2 diabetes mellitus (T2DM) and glucose intolerance. Much ongoing research is focused on identifying the genetic factors which contribute to NAFLD pathogenesis. Recently,TM6SF2 rs58542926 E167K single nucleotide polymorphisms (SNPs) are demonstrated to be associated with NAFLD,the morbidity of nonalcoholic steatohepatitis (NASH),cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). TM6SF2 is required for very low-density lipoprotein (VLDL) secretion and TM6SF2 rs58542926 E167K variant leads to lose the function of TM6SF2,which causally contributes to the attack of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease; TM6SF2 rs58542926 E167K; Single nucleotide polymorphisms; Susceptibility

張爽，碩士，碩士生導師，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎與臨床。E-mail：1209611093@qq.com

李異玲，博士，主任醫師，教授，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎與臨床。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.002

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0367-04

2015-12-01