五子降糖方對T2DM大鼠血糖、C-P及DPP-4活性影響的實驗研究*

周雪梅，董玉山，喇孝瑾，田春雨，高秀娟，賀寶玲，劉玉潔，李繼安，陳 震，史佳森，袁麗麗，仇繼超

（1.華北理工大學中醫學院，唐山 063000；2.唐山市遷西縣衛生局，遷西 064300；3.匈牙利東方國藥集團，匈牙利布達佩斯 1174）

五子降糖方對T2DM大鼠血糖、C-P及DPP-4活性影響的實驗研究*

周雪梅1，董玉山1，喇孝瑾1，田春雨1，高秀娟1，賀寶玲1，劉玉潔2，李繼安1，陳 震3，史佳森1，袁麗麗1，仇繼超1

（1.華北理工大學中醫學院，唐山 063000；2.唐山市遷西縣衛生局，遷西 064300；3.匈牙利東方國藥集團，匈牙利布達佩斯 1174）

[目的]探討五子降糖方對二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）活性的影響，研究其發揮降糖作用的可能機制。[方法]選取SPF級雄性GK大鼠，適應性喂養1周后給予高脂飼料，連續喂養4周，測定血糖，以隨機血糖＞11.1 mmol/L或餐后2 h血糖（2 h PG）＞16.7 mmol/L為成模標準，將成模2型糖尿病（T2DM）大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（0.1 g/kg）、五子降糖方低、中、高劑量組（3.5、7.0、14 g/kg，折合生藥量），同時另選Wstar大鼠為正常組，正常組與模型組灌胃等體積純凈水，灌胃前測定空腹血糖（FBG），灌胃后4周、8周測定FBG及2 h PG，8周后處死動物，檢測血清C肽（CP）水平；采用發色底物法建立DPP-4抑制劑體外篩選模型，分別應用五子降糖方及其組方的各味單藥菟絲子、女貞子、紫蘇子、萊菔子、車前子水提物對DPP-4抑制劑體外篩選模型進行干預，以磷酸西格列汀片作為陽性對照藥，測定A值，計算DPP-4抑制率，比較IC50差異。[結果]五子降糖方可降低T2DM大鼠FBG及2 h PG，增高血清C-P水平；對DPP-4抑制作用，五子降糖方IC50為（6 667.754±2 119.759）mg/L，其組成藥物中萊菔子IC50為（382.554± 7.750）mg/L，菟絲子IC50為（843.391±135.230）mg/L。[結論]五子降糖方可以降低T2DM FBG及2 h PG，改善胰島β細胞功能，作用機制可能與DPP-4抑制作用有關，其中萊菔子、菟絲子可能是本方發揮DPP-4抑制作用的主要藥物。

二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）；五子降糖方；2型糖尿病（T2DM）；GK大鼠

二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制劑是一種新型2型糖尿病（T2DM）治療藥物，主要通過延長體內胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）降解時間，促進胰島素分泌，發揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。前期實驗表明五子降糖方可有效改善糖代謝，但此方是否通過抑制DPP-4活性發揮降糖作用需要進一步驗證，本實驗觀察了五子降糖方對T2DM大鼠空腹及餐后血糖、血清C肽（C-P）的影響，建立DPP-4抑制劑體外篩選模型，對五子降糖方及其組成藥物進行篩選，探討其發揮降糖作用及改善胰島β細胞功能的新機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級GK雄性大鼠54只，體質量（300±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2012-0002，動物合格證編號2007000577867。飼養于華北理工大學10000級屏障環境動物實驗室[SYXK（冀）2010-0038]，室溫20℃，相對濕度45%，光暗周期（12 h/12 h）。

1.2 藥物與試劑 五子降糖方由菟絲子、女貞子、紫蘇子、萊菔子、車前子組成，購自北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司，磷酸西格列汀片（杭州默沙東制藥有限公司，產品批號k005113），DPP-4（Sigma公司，批號SLBK3698V），甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Sigma公司，批號SLBJ8491V），C肽測定試劑盒（北京凱諾春天生物科技有限公司，批號20150401A），二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1407117）。

1.3 主要儀器 BS224S精密電子天平（德國Sartorius公司），GZX-9240數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），M200PRO酶標儀（瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 藥物提取方法 五子降糖方按照其組成藥物菟絲子∶女貞子∶紫蘇子∶萊菔子∶車前子（3∶3∶2∶2∶2）比例混合，8倍量加水煎煮2 h，煎煮2次，2次藥液混合，濃縮收膏，濃縮收膏率31%。

2.2 GK大鼠造模、分組、給藥與指標檢測 54只GK大鼠適應性喂養1周，給予高脂飼料喂養，連續4周，測定空腹血糖（FBG）和餐后2 h血糖（2 h PG），隨機血糖＞11．1 mmol/L，2 h PG＞16．7 mmol/L[1]為成模標準，共成模50只，將成模GK大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（簡稱二甲組）、五子降糖方高、中、低劑量組（簡稱五子高中低組），每組10只。選取10只Wistar大鼠作為正常組，給予普通飼料喂養。各組灌胃相應藥物，模型組與正常組灌胃等體積純凈水，給藥量按照大鼠與人換算公式計算（每日7．5 mg/kg）[2-3]，二甲組灌胃0．1 g/kg鹽酸二甲雙胍混懸液，五子降糖方分別灌胃3．5、7．0、14．0 g/kg（折合生藥量），共給藥8周，采用葡萄糖氧化酶法測定給藥前、給藥后大鼠FBG及2 h PG，給藥8周后取大鼠腹主動脈血清，采用酶聯免疫吸附（ELISA）方法檢測C-P水平。

2.3 DPP-4抑制劑體外篩選體系的建立及對五子降糖方及組成藥物進行DPP-4抑制劑的篩選 實驗分4組[4-7]，每組設3個復孔，分別為空白組、陰性對照組、陽性對照組、陽性空白組，具體見表3。按照藥物、酶、緩沖液、底物順序加入96孔板，37℃孵育30 min，于405 nm處測定吸光度（A），經反復摸索確定反應體積為100 μL，對酶濃度、底物濃度、反應緩沖液pH值、反應時間進行優化。設1、2、3、4、5 mg/L濃度梯度的磷酸西格列汀片[8]對上述反應體系進行驗證。DPP-4抑制劑體外篩選模型建立后，保留原分組，加干預藥物組、干預藥物空白組對五子降糖方及其組方單味中藥進行篩選，干預藥物濃度設為200 mg/L，按照上述反應體系對干預藥物進行初步篩選，剔除DPP-4抑制作用不明顯的藥物，對DPP-4抑制率＞10%的藥物進行復篩，復篩藥物設25、50、100、200、400 mg/L 5個濃度梯度，測定A值，計算抑制率，比較IC50差異。

2.4 統計學處理 實驗數據應用SPSS 20．0軟件及Excel 2007進行分析，實驗結果均以均值±標準差（s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0．05為差異有統計學意義。

抑制率計算公式：[（陰性對照組-陰性空白組）-（陽性對照組-陽性空白組）]/[（陰性對照組-陰性空白組）]。

3 結果

3.1 五子降糖方對T2DM大鼠FBG和2 h PG影響 測定大鼠FBG，見表1。給藥前各組與正常組比較均有顯著性差異（P＜0．01），但各組之間不存在差異性（P＞0．05）。給藥4周后測定FBG，與正常組比較，模型組、二甲組、五子低組有顯著性差異（P＜0．01），FBG水平都高于正常組，五子中組、五子高組沒有差異（P＞0．05）。與二甲組比較，五子低組沒有顯著性差異（P＞0．05），效果相當，五子中組、五子高組均有顯著性差異（P＜0．01），效果優于二甲組，給藥8周后，FBG五子各組均與正常組無顯著性差異（P＜0．05），效果優于二甲組。測定大鼠2 h PG，見表2。給藥前模型組與五子各組之間沒有差異性（P＞0．05），給藥4周后與模型組比較二甲組、五子低組存在差異（P＜0．05），五子中組、五子高組差異顯著（P＜0．01），二甲組與五子各組比較（P＞0．05），效果相當。給藥8周后各組與模型組比較均有顯著性差異（P＜0．01），與二甲組比較五子低組存在差異（P＜0．05），五子中組、五子高組均存在顯著性差異（P＜0．01），五子各組效果均優于二甲組。

表1 五子降糖方對T2DM大鼠FBG的影響（s）mmol/L

表1 五子降糖方對T2DM大鼠FBG的影響（s）mmol/L

注：與正常組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01；與二甲組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

?

表2 五子降糖方對T2DM大鼠2 h PG的影響（s）mmol/L

表2 五子降糖方對T2DM大鼠2 h PG的影響（s）mmol/L

注：與模型組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與二甲組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

?

3.2 五子降糖方對T2DM大鼠C-P影響 正常組與模型組二甲組、五子低組比較均存在顯著性差異（P＜0．01），與五子中組、五子高組比較不存在差異（P＜0．05）。與模型組比較，二甲組、五子低組，存在差異（P＜0．05），五子中組、五子高組，存在顯著性差異（P＜0．01）。二甲組與五子低組比較不存在差異性（P＜0．05），效果相當。與五子中組比較（P＜0．01），與五子高組比較（P＜0．05），效果優于二甲組。見表3。

表3 五子降糖方對T2DM大鼠C-P影響（s） μg/mL

表3 五子降糖方對T2DM大鼠C-P影響（s） μg/mL

注：與正常組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01；與二甲組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

10 10 10組別正常組模型組二甲組n C肽n C肽10 10 10 242±08．8 202±07．3** 211±10．9**#組別五子低組五子中組五子高組212±7．7**#239±4．8##△△235±9．6**##

3.3 DPP-4抑制劑體外篩選模型的優化結果 見表4。

表4 反復摸索后DPP-4抑制劑體外篩選體系各成分加入量 μL

3.4 五子降糖方及其組成藥物對DPP-4的抑制作用 初篩結果女貞子、車前子、紫蘇子抑制作用不明顯，對萊菔子、菟絲子、五子降糖方進行復篩，復篩結果見表5。萊菔子IC50為（382．56±7．75）mg/L，菟絲子IC50為（843．39±135．23）mg/L，五子降糖方IC50為（6 667．75±2 119．76）mg/L，磷酸西格列汀片IC50為（0．11±0．00）mg/L，對DPP-4抑制作用強弱比較磷酸西格列汀片＞萊菔子＞菟絲子＞五子降糖方總方。

4 討論

2型糖尿病屬中醫消渴范疇，中醫學認為本病是一種虛實夾雜的復雜證候，《靈樞五臟》云：“腎脆則善病消癉，易傷。”《外臺秘要·消渴消中門》強調：“消渴者，原其發動，此則腎虛所致，每發即小便至甜。”進一步說明腎虧是其患病的關鍵。《素問·通評虛實論》言：“消癉……肥貴人，則膏梁之疾也。”《素問奇病論篇》云：“脾癉，此肥美之所發也，此人必數食甘美而多肥也。”則強調了過食肥甘厚味可致消癉；由此可見先天不足，氣化不及與后天飲食肥甘太過是消渴病發病的主要因素。氣化功能下降為發病之根，脂濁痰濕堆積為發病之因，五子降糖方中菟絲子溫補腎陽的同時平補腎陰，女貞子性涼，歸肝腎經，具有滋補肝腎之陰的功效，兩者合用，使腎之陰陽得補，腎氣得充，進而蒸騰、氣化推動和調節胃之“游溢精氣”、脾之“散精”、肺之“通調水道”，使津液輸布代謝正常，則痰濁無以內生。紫蘇子降氣消痰，萊菔子消食導滯、下氣除痰，車前子瀉而通之，瀉有形之邪濁，澀中兼通，補而不滯。五藥配伍使腎虛得補、氣機得暢、痰濁得化。現代藥理表明菟絲子及其單體成分可能通過抑制α-淀粉酶的活性、抗氧化應激、增強免疫功能等發揮降糖作用[9-10]，女貞子提取物及其單體成分降糖作用可能與抑制α-葡萄糖苷酶、改善胰島素抵抗相關[11]，萊菔子可以調節血脂，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平[12]。前期實驗研究表明五子降糖方可以降低2型糖尿病大鼠FBG和2 h PG血糖，增加肝臟糖原含量，其機制可能與提高骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）表達水平、抗氧化、抗炎及改善胰島β細胞功能，提高肝臟蛋白激酶（AKT）及糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）絲氨酸位點磷酸化水平有關[13-15]。由此說明該方是通過多途徑、多環節、多靶點發揮整體降糖作用的，除上述已經闡釋的作用機制外，是否還有其他改善糖代謝機制尚需進一步探討。

表5 初篩抑制率＞10%的藥物及磷酸西格列汀片對DPP-4的抑制作用（s）

表5 初篩抑制率＞10%的藥物及磷酸西格列汀片對DPP-4的抑制作用（s）

五子降糖方6 667．75±2 119．76磷酸西格列汀片4 4 50．0 100．0 200．0 400．0 25．0 50．0 100．0 200．0 400．0 000．1 000．2 000．3 000．4 000．5 0．12±0．01 0．18±0．01 0．21±0．02 040±0．01 0．09±0．01 0．15±0．01 0．17±0．01 0．20±0．01 0．26±0．01 0．48±0．01 0．64±0．01 0．75±0．01 0．78±0．07 0．82±0．00 0．11± 0．00

GK大鼠是一種自發性非肥胖型糖尿病模型大鼠，在遠交系Wistar大鼠中篩選高血糖個體而成。糖尿病發作后，很快出現高血糖、胰島素分泌減弱等癥狀，后期容易出現視網膜、微血管、神經、腎臟病變等，其發病機制與T2DM機制及其類似[16-17]。本實驗選取GK模型大鼠，結果表明，正常組GK大鼠毛色較白且有光澤，精神狀態活躍，糞便及尿量正常，模型組毛色明顯發黃無光澤，精神狀態萎靡，尿量增多且部分大鼠出現便溏，二甲組及五子各組狀況較模型組均有所改善。給藥4周后測定FBG，五子中組、五子高組可以將GK大鼠FBG降低到正常水平，五子低組與二甲組效果相當，五子中組、五子高組降糖效果優于二甲組。給藥8周測定FBG水平，五子各組均可以達到正常水平，效果優于二甲組。測定2 h PG，給藥4周后二甲組與五子各組效果無差異性，給藥8周五子各組效果均較二甲組明顯。GK大鼠模型組C-P水平減少，提示胰島β功能損傷，五子降糖方可以顯著增高C-P，降低GK大鼠FBG及2hPG水平，并且可以改善胰島β細胞功能。

近年來以DPP-4抑制為靶點的中藥降糖機制研究報道越來越多，DPP-4抑制是一種新的T2DM治療途徑，其主要通過延長體內GLP-1降解時間發揮降糖作用。GLP-1是一種腸促胰島素，體內外研究顯示GLP-1具有較好的抗糖尿病效應，它具有血糖依賴性的腸促胰島素作用，可以避免餐后高血糖的風險，同時又阻止胰腺β細胞退化，刺激β細胞的增殖和分化，促進胰島素的釋放[18-21]，可改善糖尿患者的血糖代謝。但是由于GLP-1在體內很快被以DPP-4為主的酶降解，因而抑制DPP-4能一定程度延長GLP-1在體內的半衰期，從而有效地發揮GLP-1降血糖效應。近年來，已有學者開展了以DPP-4抑制為靶點的中藥研究，并且發現葫蘆巴、鷹嘴豆、石榴皮、水蛭、茯神、密蒙花等具有一定的DPP-4抑制作用[4-6]。本實驗證明五子降糖方可以有效降低GK大鼠FBG和2 h PG血糖，改善胰島β細胞功能，為了進一步探討該方的作用機制，又對五子降糖方及其組成藥物進行了DPP-4抑制作用的篩選，實驗結果表明五子降糖方具有DPP-4抑制作用，萊菔子、菟絲子可能是其發揮DPP-4抑制作用的主要藥物，進而說明五子降糖方的DPP-4抑制作用是其降低血糖，改善胰島β細胞功能的又一作用機制，因該方均為天然植物中藥，安全性好，不良反應小，適合長期服用，對指導臨床和藥物開發具有重要意義。

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Experimental study of effect of Wuzi Jiangtang Formula on glucose and C-P of T2DM mice and DPP-4 activity

ZHOU Xue-mei1,DONG Yu-shan1,LA Xiao-jin1,TIAN Chun-yu1,GAO Xiu-juan1,HE Bao-ling1, LIU Yu-jie2,LI Ji-an1,CHEN Zhen3,SHI Jia-sen1,YUAN Li-li1,QIU Ji-chao1
（1．North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;2.Health Bureau of Qianxi County of Tangshan City,Tangshan 064300,China;3.Oriental Herbs Kft.,Budapest 1174,Hungary）

[Objective]To investigate the effect of Wuzi Jiangtang Formula on the effect of DPP-4,and study the possible mechanism of its hypoglycemic effect．[Methods]Select SPF male GK rats,the rat model of T2DM was established by feeding high fat for 4 weeks after adaptive feeding 1 week,detect blood glucose,FBG＞11．1 mmol/L or 2 hPG＞16．7 mmol/L was considered succeed model．And the T2DM rats were randomly divided into model group, metformin group,Wuzi Jiangtang Formula groups with high,medium and low dose respectively,normal group．The normal group and model group were administered intragastrically with pure water．Other groups were administered intragastrically with corresponding drugs for 8 weeks．The level of FBG was detected at the beginning of treatment, and at the ends of the 4th and 8th week．The rats were sacrificed after 8 weeks．The level of C-P were detected; Establish vitro screening model of DPP-4 inhibitor,and screen Wuzi Jiangtang Formula and its component drugs, which including Tusizi,Nvzhenzi,Suzi,Laifuzi and Chenqinzi．Select the Sitagliptin Phosphate Tablets as positive control drug．Then determine the absorbance(A),calculate the inhibition rate,and compare the difference of IC50．[Results]Wuzi jiangtang Formula can reduce the level FBG,2 hPG and C-P;IC50of Wuzi jiangtang Formula is(6 667．754±2 119．759)mg/L,IC50of Laifuzi is(382．554±7．749 6)mg/L,inhibition of DPP-4,IC50of Tusizi is (843．391±135．23)mg/L．The inhibitory effect of DPP-4 of Cheqianzi,Suzi and Nvzhenzi is less than 10%．[Conclusion]Wuzi Jiangtang Formula can reduce the level FBG and 2 h PG,improve the islet β cell function．The inhibitory effect on DPP-4 is the possible mechanism,and Laifuzi,Tusizi are probably the main drugs play an important role in the inhibition of DPP-4．

DPP-4;Wuzi Jiangtang Formula;Type 2 diabetes mellitus;GK rat

R587.1

A

1673-9043（2016）06-0390-05

2016-07-01）

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.06.08

河北省科技計劃項目（13392502D）；河北省中醫藥管理局科研計劃項目（2013066）；華北理工大學大學生創新創業訓練計劃項目（X2014112）。

周雪梅（1988-），女，碩士研究生，主要從事中醫糖脂代謝疾病研究。

李繼安，E-mail:lnyy@vip.sina.com。