AccQ—Tag法測定依替巴肽的氨基酸比值

孫井龍 湯征

【摘要】目的：建立反相色譜法測定依替巴肽的氨基酸比值。方法：采用以 6- 氨基喹啉- N- 羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）與各氨基酸柱前定量衍生后，經反相色譜測定。結果：在范圍內各氨基酸的線性關系良好，精密度，溶液穩定性，回收率均良好。結論：該方法準確可靠，重現性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸組成的測定。

【關鍵詞】AccQ- Tag；依替巴肽；氨基酸比值

ABSTRACT OBJECTIVE：To establish an HPLC method for determination of Amino acid ratio in eptifibatide . METHODS：the 6-amino decoquinate-N-hydroxyl succinyl imide formicether （ AQC） was taken as the derivative reagent to make for the column quantitative derivatization with each amino acid and then to elute by Reverse phase chromatography.RESULTS：Good linearities were obtained for all amino acids.The method showed high selectivity，good repeatability，accuracy and stability . CONCLUSION：The method is simple and rapid and it is applicable for determination of Amino acid ratio in eptifibatide.

KEY WORDS AccQ- Tag； ptifibatide；Amino acid ratio；

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2016）01-0015-02

氨基酸比值測定是多肽藥物質量控制的重要環節，也是多肽原料藥質量標準的重要組成部分，通過測定多肽藥物的氨基酸理論個數比，從側面佐證多肽的結構。因此，對氨基酸比值的分析，可為多肽的結構確證提供理論指導。建立準確可靠的氨基酸比值分析方法是一項有意義的工作。國內外研究和應用于實際樣品中氨基酸比值分析的方法主要是色譜方法， 包括離子交換法、 反相高效液相色譜法、 氣相色譜法[1]， 按檢測方法可分為化學分析法、 電化學方法、 分光光度法等， 按衍生反應的先后， 可分為柱前衍生[2]和柱后衍生法。氨基酸分析儀是柱后衍生反相高效液相色譜法的代表，已有很廣泛的應用。在柱前衍生反相高效液相色譜法方面，不同的衍生劑對應不同的方法，是目前研究的主體模式。筆者采用 WATERS 公司的 AccQ- Tag 試劑包[3]作為構建方法的基本條件，通過優化依替巴肽中氨基酸的前處理和色譜條件，以 6- 氨基喹啉- N- 羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）為衍生試劑與各氨基酸柱前定量衍生后，再經普通C18柱梯度洗脫， 建立了依替巴肽中氨基酸比值的 AccQ- Tag 測試方法， 應用于實際樣品的分析。結果表明， 此方法具有專屬性，靈敏度高、 重現性好。

1 實驗部分

1.1儀器及試藥

L-門冬氨酸（批號：A0546）、甘氨酸（批號：G0099）、L-高精氨酸（批號：GJ01）、L-脯氨酸（批號：P0481）、L-胱氨酸（批號：C0519）對照品均購于：東京化成工業株式會社；依替巴肽原料藥（批號：20071019 連云港宏創藥業有限公司）； AccQ- Tag試劑盒（Waters）；乙腈、磷酸為色譜純，三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉，乙二胺四乙酸鈉均為分析純。

Agilent 1200系列（G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B紫外-可見光檢測器），Agilent化學工作站；梅特勒XS105 電子分析天平 ；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 AccQ-Tag 衍生溶液的制備 取衍生化試劑（2A）加人1ml乙腈，于55℃恒溫鼓風干燥箱內使溶解，得衍生溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取依替巴肽原料藥約10.5mg，于裂解瓶中，加入5mL 6mol/L的鹽酸溶液，充氮密閉，于120℃條件下反應24小時，取出放置至室溫，用氫氧化鈉溶液中和至中性，轉移至50ml量瓶中，用水定容，精密移取100μl置進樣瓶中，加入700μl硼砂緩沖溶液，再加入200μl已配制好的衍生化試劑溶液，混勻后，放入已恒溫至55℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中，反應10分鐘后，作為供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取門冬氨酸（Asp）對照品16.6mg，甘氨酸（Gly）對照品9.4mg，高精氨酸（Harg）對照品28.0mg，脯氨酸（Pro）對照品14.4mg，胱氨酸（Cys）對照品15.0mg，置于50ml量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，混勻；精密移取2ml置裂解瓶中，加入6mol/L的鹽酸5ml，充氮密閉，于120℃條件下反應24小時，取出放置至室溫，用NaOH中和至中性，轉移20ml量瓶中，用水定容，用水稀釋到刻度，混勻；精密移取100μl置進樣瓶中，加入700μl硼砂緩沖溶液，再加入200μl已配制好的衍生化試劑溶液，混勻后，放入已恒溫至55℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中，反應10分鐘后，取出放置至室溫，作為對照品溶液。

1.2.4色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05mol/L醋酸鈉緩沖液（取乙酸鈉11.5g，溶于900ml水中，加入1ml 1mg/ml乙二胺四乙酸二鈉，再加入2.4ml三乙胺，磷酸調pH值至4.95，加水至1000ml）為流動相A；乙腈-水（60∶40）為流動相B；檢測波長254nm；進樣體積10μl；流速1.0mL/min；柱溫37℃。；采用梯度洗脫：

2結果與討論

2.1系統適用性試驗

以衍生化后的對照品溶液檢查系統適應性，按 “1.2.4”色譜條件，連續進 5 針對照品溶液，門冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、高精氨酸（Harg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）的衍生化產物依次出峰，色譜圖中相鄰的兩個峰最小分離度符合規定（R≥1.5），分別計算各氨基酸峰面積的相對標準偏差（RSD），結果顯示 RSD 值均小于 2. 0%，表明該色譜系統穩定可靠。取：“1.2.2”、“1.2.3”項下兩種溶液適量，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示。兩種溶液色譜圖見圖1、2。

2.2方法專屬性

為了驗證衍生試劑對氨基酸衍生物是否產生干擾，以水為樣品，按照 “1. 2. 2”進行衍生，得衍生空白溶液。按照 “1. 2. 1”制備衍生樣品溶液，分別進樣衍生空白溶液及衍生樣品溶液。結果表明，衍生試劑峰對各氨基酸衍生物峰均無干擾，各氨基酸獲得良好分離。

2.3檢測限與定量限

配置各氨基酸濃度為100μmol/L的貯備液，用純水稀釋分別測定各氨基酸的檢測限定量限。

2.4線性與范圍

取氨基酸對照品配制成約為供試品濃度10%～500%相應溶液測定氨基酸的線性與范圍，結果如下：門冬氨酸濃度在0.99nmol/ml～49.71nmol/ml范圍內，線性關系良好（n=7）；A = 18.4477×C+1.9320，r=0.9992。甘氨酸濃度在0.99nmol/ml～102.86nmol/ml范圍內，線性關系良好（n=8）；A =25.1343×C+7.5896，r=0.9993精氨酸濃度在1.00nmol/ml～100.27nmol/ml范圍內，線性關系良好（n=8）；A = 28.6629×C -11.6078，r=0.9999脯氨酸濃度在1.00nmol/ml～50.17nmol/ml范圍內，線性關系良好（n=7）；A = 23.5634×C +4.2263，r=0.9998。

2.5穩定性試驗

取樣品（批號：20071019），按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，并在室溫下放置，分別與2、4、6、8、12、24時進行測定。結果，門冬氨酸濃度平均值為90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸濃度平均值為86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸濃度平均值為87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸濃度平均值為108.60mol/L，SD= 0.57%；，表明供試品溶液在24小時內穩定性良好。

2.6重復性試驗

取同一樣品（批號：20071019），按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定各氨基酸的含量，重復測定6次。門冬氨酸濃度平均值為90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸濃度平均值為86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸濃度平均值為87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸濃度平均值為108.60mol/L，SD= 0.57%，表明方法重復性良好。

2.7回收率試驗

取樣品（批號：20071019），按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，作為回收率基質，分別配置80%、100%與120%的對照品溶液進行加樣回收試驗，結果如下：門冬氨酸平均回收率為97.9%，RSD為1.71%，甘氨酸平均回收率為94.4%，RSD為1.36%，精氨酸平均回收率為99.7%，RSD為1.65%，脯氨酸平均回收率為100.4%，RSD為1.26%。

2.8樣品測定

3 結論

本文建立了HPLC與柱后衍生相結合檢測依替巴肽中氨基酸比值的分析方法，對該分析方法進行了方法學驗證。實驗結果表明，該方法選擇性好，具有良好的線性、專屬性、準確性和重復性，能快速高效地測定依替巴肽中的氨基酸比值，可滿足生產企業及檢測機構的實際要求，同時可為其他多肽類藥物中氨基酸的檢測分析提供參考。

參考文獻：

[1]李方樓，姬小明，魏躍偉等.AccQ-Tag-HPLC 法測定煙葉生長過程中游離氨基酸的變化[J].安徽農業科學.2011，39（27）：17010-17012

[2]張 怡，孫晉紅，葉汝漢.反相高效液相色譜測定依替巴肽注射液中氨基酸的含量[J].分析測試學報.2013，32（8）：1003-1006

[3]朱偉偉，藍建京.犀牛角氨基酸組成分析與營養價值評價[J].江蘇農業科學.2013，41（4）：289-290