促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞的抗凋亡作用及對AKT蛋白表達的影響

許衛，陳永權，伍金雷，劉欣，陳晞明△，陳盛強，孫衛文

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促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞的抗凋亡作用及對AKT蛋白表達的影響

許衛1，陳永權1，伍金雷1，劉欣1，陳晞明1△，陳盛強2，孫衛文2

摘要：目的觀察促紅細胞生成素（EPO）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌細胞的抗凋亡作用及對蛋白激酶B （AKT）蛋白表達的影響。方法30只成年雄性SD大鼠先按隨機數字表法分為2組，假手術（Sham）組（n=6）和模型（Model）組（n=24）；模型組采用腹主動脈縮窄術建立CHF模型，術后8周存活16只，再隨機分為EPO組與對照（Control）組各8只。EPO組予以3 000 U/kg EPO腹腔注射，3次/周，連續4周；Sham組、Control組給予等量的生理鹽水。分別在術后4周、8周、12周（即給藥4周）行心臟彩超檢查大鼠心功能。第12周末全部大鼠禁食24h后處死，觀察心肌組織細胞形態、心肌細胞凋亡及計算凋亡指數（AI）；采用Western blot法檢測心肌P-AKT/AKT蛋白表達情況。結果超聲心動圖顯示Model組4周時出現心室肥厚，8周時出現心力衰竭；EPO干預4周后較Control組左室射血分數（LVEF）明顯升高（P < 0.05），收縮末期室間隔厚度（IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPWd）明顯降低（P < 0.05）。EPO組AI較Control組顯著降低（23.87%±1.45% vs 35.58%±2.81%，P < 0.01）；與Sham組（0.81±0.17）比較，Control組（0.35±0.06）P-AKT/AKT OD值明顯降低，EPO組（1.61±0.16）較Control組升高（P < 0.01）。結論EPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌細胞凋亡，促進AKT的磷酸化。

關鍵詞：紅細胞生成素；心力衰竭；心肌凋亡；AKT蛋白

慢性心力衰竭（chronicheart failure，CHF）是多種心血管疾病的最終歸宿，嚴重影響著患者的生活質量和健康水平，給家庭帶來了沉重的經濟負擔[1]。新近有研究發現促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）對大鼠急性心肌梗死、急性心力衰竭具有保護作用[2-3]。目前有關EPO對CHF的治療作用尚少見報道。本研究擬建立大鼠CHF模型，并予以EPO干預，通過觀察超聲心動圖、心肌細胞凋亡率以及蛋白激酶B（AKT）磷酸化的表達，探討EPO是否具有抗CHF心肌凋亡作用及其可能的機制，旨在為CHF的治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物8～12周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質量（241.40±16.70）g，購自南方醫科大學實驗動物中心。所有大鼠均在相同的條件下飼養，自由取食和飲水。飼料由南方醫科大學實驗中心提供。

1.1.2藥品及試劑EPO（10 000 U/mL）購自沈陽三生制藥公司，TUNEL試劑盒購自Sigma公司，AKT與P-AKT抗體均購自Cell Signaling Technology（USA），GAPDH抗體購自ProteinTech Group，Inc（USA）。

1.2方法

1.2.1分組及模型建立采用隨機數字表法，先將30只大鼠分為模型（Model）組（n=24）與假手術（Sham）組（n=6）。模型組采用腹主動脈縮窄法建立CHF模型。術前1 d禁食水，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉，打開腹腔、暴露左腎靜脈，距左腎靜脈上方10～15mm處鈍性分離腹主動脈，用4-0絲線穿過分離的腹主動脈，在腹主動脈旁置7號針（直徑0.7mm），與腹主動脈平行，結扎后抽出針，拔針時以有箍筋感為宜，使腹主動脈縮窄達60%～70%，關閉腹腔。術后常規腹腔注射阿米卡星（0.2mL/d）抗感染3 d，飼養觀察8周，制成CHF模型。Sham組：在腹主動脈相同部位穿線但不結扎，余同模型組。

1.2.2模型建立后分組和干預術后8周末Model組存活16只，將存活的16只Model組大鼠再次按隨機數字表法分為2組：EPO組（n=8）；將10 000 U/mL EPO用生理鹽水稀釋成1 000 U/mL，按3 000 U/kg EPO腹腔注射，3次/周，連續4 周[4]。Control組（n=8）予等量生理鹽水腹腔注射，3次/周，連續4周。Sham組處理同Control組。12周末時，Control組死亡2只，Sham組與EPO組無死亡。

1.2.3心臟彩超檢查分別在術后4周、8周、12周（即給予EPO 4周）后行心臟彩超檢查大鼠心功能。禁食24h后，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉、備皮，應用超聲心動儀（ie33型號，PHILIPS公司）及7.5mHz高頻線控探頭（PHILIPS公司）進行超聲檢測。檢測左室射血分數（LVEF）、收縮末期室間隔厚度（IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPWd）。

1.2.4心內采血和心肌組織標本處理于第12周末全部大鼠禁食24h行心臟彩超檢查后，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉，開胸，心內穿刺采血，剪取全部大鼠心尖部約5mm×5mm×5mm心肌組織，放入預冷的PBS溶液中沖洗至溶液無紅色，置于液氮中速凍后存于-80℃超低溫冰箱，待分子生物學實驗用；剩余部分心臟組織經預冷的生理鹽水溶液灌注3min，再經4%多聚甲醛溶液灌注固定20～30min后取心臟，立即置于4%多聚甲醛緩沖液固定，常規石蠟包埋，制成3～4 μm厚石蠟切片，待用。

1.2.5病理檢查從上述已制成的石蠟切片中，各組隨機取3張切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，200倍光鏡下觀察，鏡下觀察各組心肌組織形態結構及炎癥細胞浸潤情況。

1.2.6TUNEL原位末端標記法檢測細胞凋亡從已制成的石蠟切片中，各組隨機取3張切片，按照TUNEL試劑盒操作方法檢測心肌細胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞熒光顯色并采取圖像，再進行DAB顯色，每張切片在高倍鏡（×400）下隨機讀取6個不重疊視野，以細胞核中有染成棕色為陽性細胞。計數后，計算細胞凋亡指數（AI）=單視野凋亡陽性細胞數/單視野總細胞計數×100%，取其平均值進行統計分析。

1.2.7Western blot法測定P-AKT/AKT蛋白表達心肌組織經研磨、裂解后用酶標儀測蛋白濃度，根據所測得蛋白濃度上樣總蛋白質量為80 μg，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用電印跡轉移法將蛋自質轉至PVDF膜，麗春紅S染色，根據所需目標條帶剪膜，用質量濃度為5%的脫脂奶粉的TBS-T溶液室溫封閉2h后，分別加入兔抗AKT、P-AKT單克隆抗體和GAPDH抗體，4℃孵育過夜，室溫下TBS-T溶液洗膜后加入兔（鼠）二抗孵育2h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑反應，膠片曝光，掃描膠片，用Image J軟件計算條帶光密度（OD）值，以AKT、P-AKT與GAPDH條帶的OD比值來評定的AKT、P-AKT蛋自質的表達水平。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用t檢驗；多組均數間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1建模、EPO干預前后超聲心動圖指標的變化見表1。造模4周后，Sham與Model組大鼠LVEF差異無統計學意義（P>0.05）；Model組LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd顯著升高（P < 0.05），表明Model組大鼠發生心肌肥厚。造模8周后，Model組大鼠LVEF顯著下將（P < 0.01），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham組（P < 0.05），表明Model組大鼠CHF模型建立成功。建模12周（EPO組給藥4周），與Sham組比較，Control組大鼠LVEF進一步下降（P < 0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd進一步增高（P < 0.05），表明Control組大鼠心力衰竭進一步加重；與Control組比較，EPO組大鼠LVEF明顯增加（P < 0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明顯降低（P < 0.05），表明EPO能夠改善CHF大鼠的心功能，逆轉心室肥厚。

Tab.1　Comparison of echocardiography 4, 8 and 12 weeks of operation 表1建模后4、8、12周超聲心動圖比較　（±s）

Tab.1　Comparison of echocardiography 4, 8 and 12 weeks of operation 表1建模后4、8、12周超聲心動圖比較　（±s）

＊P < 0.05，＊＊P < 0.01；a與Sham組比較，b與Control組比較，P＜0.05；表2同

周數組別Sham組Model組t Sham組Model組t Sham組Control組EPO組t 4 4　8 8　1 2 n6 1 6　6 1 12 12 6　6 6 8 LVPWs（cm）0.276±0.005 0.355±0.015 5.467＊＊0.297±0.020 0.381±0.021 5.237＊＊0.310±0.039 0.439±0.009a0.354±0.008b10.177＊＊IVSs（cm）0.278±0.007 0.327±0.060 2.420＊0.311±0.008 0.364±0.022 3.265＊＊0.334±0.017 0.392±0.010a0.375±0.019b5.755＊LVPWd（cm）0.171±0.008 0.264±0.012 3.136＊0.192±0.009 0.294±0.025 3.148＊＊0.206±0.013 0.307±0.011a0.243±0.014b13.584＊＊IVSd（cm）0.167±0.004 0.228±0.013 2.283＊0.187±0.008 0.242±0.020 2.515＊0.199±0.011 0.271±0.008a0.215±0.015b7.322＊＊LVEF 0.884 8±0.183 2 0.826 0±0.130 5 1.409 0.865 7±0.145 3 0.655 7±0.167 2 8.426＊＊0.823 5±0.137 8 0.606 3±0.272 1a0.716 6±0.348 2ab32.308＊＊

2.2HE染色結果Sham組新生鼠心肌細胞排列整齊而緊密，染色清晰，結構完整，細胞核致密、清晰可見，呈橢圓形或長桿形，顯藍色，見圖1A。Control組心肌細胞排列紊亂，細胞核不規則，呈濃縮狀，心肌間質水腫明顯，部分心肌發生纖維化，有炎性細胞浸潤、聚集，見圖1B。EPO組心肌細胞排列紊亂、間質水腫及炎性細胞浸潤、聚集均較Control組減輕，見圖1C。

2.3心肌細胞凋亡的變化Sham組細胞核清晰可見，核較大，邊界清楚，染為藍色，見圖2A。Control組可見大量棕色深染的固縮、聚集的呈棒狀的細胞核（箭頭所示），為發生凋亡的細胞核，見圖2B。EPO組深染的棕色細胞核較Control組明顯減少，見圖2C。與Sham組比較，Control組AI顯著增加；與Control組比較，EPO組AI有所降低，但仍高于Sham組（P < 0.01），見表2。

Tab.2　Comparison of the expression of P-AKT /AKT protein (OD) andmyocardial apoptosis index (AI) between three groups表2　各組P-AKT/AKT蛋白相對表達量（OD）及心肌細胞凋亡指數（AI）比較　（±s）

Tab.2　Comparison of the expression of P-AKT /AKT protein (OD) andmyocardial apoptosis index (AI) between three groups表2　各組P-AKT/AKT蛋白相對表達量（OD）及心肌細胞凋亡指數（AI）比較　（±s）

組別Sham組Control組EPO組F n6 6 8 P-AKT/GAPDH 0.473±0.101 0.248±0.056a0.866±0.078ab16.864＊＊AKT/GAPDH 0.644±0.048 0.654±0.037 0.612±0.062 0.309 P-AKT/AKT 0.810±0.173 0.351±0.067a1.623±0.156ab24.437＊＊AI（%）8.03±0.89 35.58±2.81a23.87±1.45ab53.128＊＊

2.4Western blot法檢測心肌P-AKT/AKT蛋白表達各組AKT/GAPDH的OD值差異無統計學意義（P > 0.05）。與Sham組比較，Control組P-AKT/GAPDH及P-AKT/AKT OD值均明顯降低；與Con? trol組比較，EPO組P-AKT/GAPDH及P-AKT/AKT OD值均顯著升高，且高于Sham組（P < 0.05），見表2、圖3。

Fig.3　The expression of P-AKT /AKT protein inmyocardial samples twelve weeks after operation detected by Western blot assay圖3　Western blot檢測建模12周后心肌P-AKT/AKT蛋白的表達情況

3　討論

3.1EPO在心力衰竭中的作用CHF的病理生理改變十分復雜。研究發現，細胞凋亡在CHF中起了重要作用[5]。心肌細胞凋亡可引起心肌細胞數量減少，進而引起心肌收縮功能的下降，當心肌細胞減少到一定程度必然引起CHF的進行性惡化，最終導致心室壁變薄、心腔擴大，嚴重影響患者的預后。心肌細胞凋亡與炎性細胞因子、交感神經活性增加、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RASS）激活等多因素的作用最終導致CHF。EPO是一種造血生長因子，新近研究發現EPO還具有抗炎、抗凋亡、促進新生血管生成等多種作用來發揮組織保護作用[6]。然而，EPO是否具有抗凋亡作用改善CHF的心功能、逆轉心室肥厚的作用的研究國內外少見報道。本課題組前期研究采用腹主動脈縮窄術建立CHF模型，腹主動脈縮窄術是建立壓力超負荷心力衰竭模型常用的方法，在腹主動脈縮窄術術后6周大鼠便出現失代償性心力衰竭[7]。本研究在造模后8周（EPO干預前）Model組大鼠心臟肥厚、心功能降低，這與以往的研究相同[7]，表明心力衰竭模型成功建立。實驗結束時（EPO干預后），EPO組較Control組心功能參數上LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd及LVEF明顯改善,說明EPO能明顯改善心力衰竭大鼠心功能，逆轉心室肥厚。本研究結果顯示，與Sham組相比，Control組心功能顯著惡化，細胞AI顯著升高，P-AKT/AKT顯著降低；EPO干預后，EPO組心功能較Control組顯著改善，細胞AI較Control組顯著減輕，P-AKT/AKT顯著升高。該結果不僅證實心肌細胞凋亡是CHF的發生、發展及惡化的重要環節，同時還表明EPO干預可有效改善CHF大鼠的心功能，該作用可能與抑制心肌細胞凋亡及增加AKT的磷酸化有關。

3.2P-AKT/AKT在EPO治療CHF中的影響給予EPO干預后，多種心肌保護手段都能夠主動募集信號轉導通路，其中就有PI3K-AKT信號轉導通路[8]。PI3K-AKT信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路，是許多生命活動中的關鍵信號分子[9]。P13KAKT是調節細胞增殖、分化和凋亡的重要信號轉導途徑，通過AKT磷酸化，誘導抗凋亡或下調促凋亡的蛋白表達而抑制凋亡。因此，P13K-AKT是細胞存活和抗凋亡的關鍵性途徑。AKT是PI3K下游的最重要的靶酶，負責傳遞PI3K的始動信息。因此，有研究認為心肌保護作用的機制有一部分是依賴于AKT的磷酸化[8，10]。而本實驗所測指標P-AKT/AKT升高說明PI3K-AKT通路被激活，說明這一通路可抑制細胞凋亡，從而減輕心肌細胞的損傷，其機制可能與這一通路調控Caspase-3、Caspase-8以及Bcl-2家族參與抗心肌細胞凋亡的保護作用相關[11]；同時，該通路也是細胞存活的重要途徑，參與激活下游JAK2、STAT3/5等而發揮作用[12]。

綜上，EPO對CHF模型大鼠具有抗心室重構、改善心肌凋亡的作用，這與相關研究結論一致[13-14]。EPO促進AKT蛋白的磷酸化，從而發揮抗凋亡作用，將作為改善心力衰竭患者心功能的一個新靶點，但其作用機制有待進一步研究。

（圖1、2見插頁）

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（2015-06-15收稿2015-08-31修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of erythropoietin on apoptosis and expression of AKT in rats of chronicheart failure

XU Wei1，CHEN Yongquan1，WU Jinlei1，LIU Xin1，CHEN Ximing1△, CHEN Shengqiang2，SUN Weiwen2
1 Department of Cardiology, The Third Affiliatedhospital of Guangzhoumedical University，Guangzhou 510150，China；2 The Second Affiliatedhospital of Guangzhoumedical College
△Corresponding Author E-mail：13903004891@163.com

Abstract：Objective To investigate the effects of erythropoietin (EPO) onmyocardial apoptosis and protein kinase B (AKT) expression in rats of chronicheart failure (CHF).Methods Thirtymale adult SD rats were randomly divided into two groups, sham-operated (Sham) group (n = 6) andmodel (Model) group (n = 24).The abdominal aortic coarctation was used to build CHFmodel.Sixteen survived rats after operation were randomly divided into two groups including EPO group and con?trol (Control) group.EPO group was received 3 000 U/kg EPO intraperitoneal injection 3 times /week for 4 weeks, and Sham group and Control group were received same volume of normal saline.The echocardiography was used to evaluate cardiac function after 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks of treatment.After 12 weeks, all rats were sacrificed after 24h fasting.The cellmorphology andmyocardial apoptosis were observed, and apoptosis index (AI) was calculated.Myocardial P-AKT /AKT pro?tein expression was detected by Western blot assay.Results Echocardiography showed that ventricularhypertrophy was found inmodel group after four weeks,heart failure 8 weeks.Compared with Control group, left ventricular ejection fraction (LVEF) was significantlyhigher after EPO intervention for 4 weeks (P < 0.05), systolic interventricular septum thickness (IVSs), end-systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWs), diastolic interventricular septum thickness (IVSd), af?ter left ventricular end-diastolic wall thickness (LVPWd) were significantly lower (P < 0.05).The value of AI was significant?ly lower in EPO group than that of Control group (23.87%±1.45% vs 35.58%±2.81%, P < 0.01).The OD value of P-AKT /AKT was significantly decreased in Control group (0.35±0.06) than that of Sham group (0.81±0.17), the value was significant?ly increased in EPO group (1.61±0.16) than that of Control group (P < 0.01).Conclusion EPO can improveheart function，inhibitmyocardial apoptosis，and promote pro-phosphorylation of AKT in rats with chronicheart failure.

Key words：erythropoietin；heart failure；cardiac apoptosis；AKT protein

通訊作者△E-mail：13903004891@163.com

作者簡介：許衛（1987），男，在讀研究生，住院醫師，主要從事冠心病防治相關研究

基金項目：廣東省科技廳項目（2013B022000103）

中圖分類號：R541.6

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59073

作者單位：1廣州醫科大學附屬第三醫院心內科（郵編510150）；2廣州醫科大學附屬第二醫院