CD-DST技術：為腫瘤細胞量“身”定藥

徐偉　李文迪　鄧天穎　張志高　杜紅延

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CD-DST技術：為腫瘤細胞量“身”定藥

徐偉李文迪鄧天穎張志高杜紅延★

［摘要］腫瘤原代細胞三維立體培養法藥敏檢測技術（collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是一種先進的體外化療藥物敏感性檢測方法，相對于其它方法有著無可比擬的優勢，比如細胞用量少、簡便快速等。自該法建立以來，大量基于此平臺的臨床研究便陸續開展起來，主要針對一些常見的惡性腫瘤，如大腸癌、乳腺癌等。大量研究證實，CD-DST技術的檢測結果與臨床治療效果的擬合程度很高，應用該方法模擬的化療方案，患者都取得了較好的療效。CD-DST對于建立腫瘤患者的個體化治療方案有著重要的指導意義，相信隨著技術的不斷發展以及更廣泛的應用，會在個體化治療中得到更廣泛的應用。本文綜述了CD-DST技術的建立及研究進展，有望為該技術的發展提供新的思路，為腫瘤患者提供新的治療手段。

［關鍵詞］體外藥敏檢測；腫瘤；CD-DST；化療

作者單位：南方醫科大學生物技術學院，廣東，廣州510515

注：徐偉和李文迪為并列第一作者

隨著社會經濟和醫療衛生的發展，健康已成為人們越來越關心的問題。浙江大學醫學院巴德年院士提出“3P”醫學理念，被譽為21世紀醫學發展的新方向?！?P”醫學指的是預防醫學（preventive）、預測醫學（predictable）和個體化醫學（personal）。其中“個體化”在慢性疾病治療中的重要性和必要性日益提升，特別是在腫瘤的診療方面。化療是治療腫瘤的主要手段之一，但由于腫瘤的個體化差異，同一化療手段對不同腫瘤患者甚至不同腫瘤的療效差異較大，盲目的使用化療藥物不但會給患者帶來不必要的經濟損失，甚至會導致治療失敗。顯而易見，在患者進行化療前，利用體外檢測技術檢測患者腫瘤對化療藥物的敏感性相當重要。傳統的體外檢測藥敏性的方法有很多，比如琥珀脫氫酶抑制試驗、四唑藍比色法、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物熒光體外藥敏檢測法及立體組織培養藥物檢測試驗等，它們在一定程度上解決了部分腫瘤個體化治療的問題，但限制條件多，檢測效果并不理想。在此研究背景下，腫瘤原代細胞三維立體培養法藥敏檢測技術（collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）應運而生。

最初有報道稱在膠原培養基上進行肝細胞單層培養可以成功維持細胞的形態與功能［1］。隨后Yang［2］等研究者便嘗試將小鼠乳腺癌上皮細胞種植于膠原培養基上，他們發現在膠原形成的三維立體結構中可以提供類似體內細胞的生長環境。經歷了近20年的試驗和探索，最終在1997年，Kobayashi［3］等人在已有的經驗基礎上正式建立了一種新型體外藥敏檢測技術——CD-DST技術。CD-DST技術一出現便以其培養成功率高、細胞需量少、所培養細胞的生物學特性與體內相似、結果可靠性強等優點得到了廣泛的重視。到目前為止，CD-DST技術已被應用于部分實體瘤的臨床治療和研究中，取得了一定程度的認可。本文主要針對近年來CD-DST技術在臨床上的研究應用進行綜述，以便為后續研究者提供一定的幫助。

1　CD-DST的原理及特點

在機體內，細胞外基質可以為細胞提供獲取營養和排出代謝物的穩定生長場所。同樣，腫瘤組織也是由腫瘤細胞、組織細胞和細胞外基質所構成，腫瘤細胞所處的微環境對腫瘤細胞的生長繁殖具有重要影響。CD-DST技術采用的膠原凝膠在37℃時可以形成三維立體的結構，模擬體內細胞的生長微環境，腫瘤細胞得以在類似體內的環境下生長，在其細胞形態、生長狀態與體內腫瘤細胞相似的情況下對抗癌藥物進行定量分析便可得到較準確的結果。

CD-DST技術的主要流程包括以下5部分：（1）原代腫瘤細胞懸液制備：取新鮮腫瘤組織機械分離，用組織消化酶消化2 h～3 h后，通過80 μm的篩網過篩形成單細胞懸液；（2）腫瘤細胞單層培養：將上述細胞懸液加入到I型膠原蛋白包被的細胞培養瓶中培養24 h，棄上清未貼壁死細胞；（3）膠原凝膠內培養：用膠原酶消化上述細胞得到細胞懸液，計數后將活細胞加入膠原凝膠混合液中混勻，在冰浴條件下接種于六孔板37℃培養，形成膠滴后加入培養基培養過夜；（4）待測藥物添加：將待測抗癌藥物加入六孔板中，繼續培養24 h后清洗細胞除去抗癌藥物，將細胞轉移至無血清培養基中培養7 d；（5）結果分析和評估：利用中性紅染色、甲醛固定，經掃描將圖像傳輸到計算機，利用圖像分析藥物的抑制率，評估藥物體外的殺傷效果［4］。具體流程如圖1所示。

2　CD-DST技術的臨床研究進展

2．1大腸癌

近年在我國，大腸癌的發病率也在逐年攀升。目前對于腫瘤治療公認的最佳方案是進行個體化治療，而其中首要的就是為大腸癌患者篩選敏感有效的化療藥物進行有針對的治療。為患者進行藥物敏感性的體外檢測可以有效提高治療效果，減少藥物帶來的不良反應。CD-DST技術在發展初期便被用于確定多種針對大腸癌的化療藥物的有效治療濃度，其結果被應用于癌細胞的殺傷動力學試驗。Ochiai［5］等人利用該技術檢測大腸癌細胞對5-氟尿嘧啶（5-fluoropyrimidine，5-FU）的敏感性，并通過分析上述試驗的數據明確了所檢測患者對該藥的反應程度與體外敏感性之間的關系。

近幾年，隨著藥物基因組學的發展，發現化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效應與基因的多態性和表達水平有關，其中藥物的目標酶和代謝酶的表達和活性尤為重要。在該方面研究中，CD-DST技術主要參與探究大腸癌細胞中5-FU藥物敏感性與相關代謝酶活性之間的關系，其中包括胸苷酸合成酶（thymidylate，TS）、二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine，DPD）和乳清酸磷酸核糖轉移酶（orotate phosphoribosyltransferase，OPRT）。研究人員認為DPD和OPRT活性具有預測5-FU藥物敏感性的潛力，若將CD-DST技術與細胞酶活性檢測相結合可能會更有效地預測藥物敏感性［6］。參與腫瘤形成的一些關鍵分子，也在腫瘤細胞耐藥性的形成中發揮著重要作用。Syndecan1分子（CD138）屬粘附分子整合素跨膜粘結蛋白（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）家族成員，可與多種因子結合，參與組織器官分化發育、血管形成、組織再生等一系列生理過程的調節，并與腫瘤細胞歸巢及轉移等過程有關，也是判斷某些腫瘤預后的指標。研究表明，Syndecan1分子在大腸癌細胞中的脫落增加，導致了癌細胞對CD-DST技術指導下的體外化療的耐藥性升高，這可能是由于Syndecan1分子的脫落使表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化增強繼而下調了該通路的信號，最終導致了大腸癌細胞對化療藥物的耐藥性升高［7］。筆者認為，由于CD-DST技術結果與臨床化療的相關性較高，可以利用CD-DST技術明確一些與腫瘤發生發展密切相關相關的分子對化療的影響，以此來有針對性地篩選化療藥物，這將會對大腸癌個體化治療的建立有著十分積極的意義。

不同時期的腫瘤對化療的敏感性不同，在個體之間的差異更為顯著。近期，在針對Ⅱ～Ⅲ期大腸癌的研究中發現在CD-DST技術輔助下以5-FU為基礎的輔助化療藥物治療的成功率為79．9%［8］；此后在利用CD-DST技術指導Ⅳ期大腸癌患者的用藥治療中，接受體外檢測敏感藥物治療的患者比接受體外檢測不敏感藥物治療的患者的藥效反應率、無進展生存期和總生存期均提高2倍左右［9］，提示以CD-DST技術結果為依據選擇的化療方案能明顯延長患者生存時間，改善患者預后。

為提高試驗的準確率和成功率，研究者有針對性地對CD-DST技術進行了改進。雜菌污染是導致大腸癌細胞培養失敗的主要原因，有試驗表明提前用抗生素灌洗大腸癌標本可以有效控制雜菌污染，提高腫瘤細胞生長率［10］。在探究蛋白結合多糖-K（protein-bound polisaccharide，PSK）與氟尿嘧啶衍生物在胃腸道癌癥抗癌作用關系的試驗中，為更好模擬體內免疫環境，CD-DST體系中還加入了外周血單核細胞，即建立了免疫CD-DST技術（Immuno-CD-DST），并證實該改進可以更好地用于評估藥物的免疫機制［11］。綜上而言，通過一系列CD-DST技術在大腸癌治療中的應用，證明該技術可有效地補充化療準備期信息的不足，為通向大腸癌個體化治療打下堅實基礎。

2．2乳腺癌

全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢，每年約有50萬人死于乳腺癌，近年來我國乳腺癌發病率的增長速度呈持續走高態勢［12］。乳腺癌具有遺傳異質性，不同患者的個體差異較大，因此乳腺癌的個體化治療就顯得尤為重要。在乳腺癌中，CD-DST技術多被應用于檢測個體癌細胞對藥物敏感性。CD-DST技術被用于檢測以吡柔比星（pirarubicin，THP）和表柔比星（epirubicin，EPI）藥物方案為基礎的化療藥物對乳腺癌的化療效果的結果表明CD-DST技術檢測乳腺癌化療藥物敏感性的可行性高［13］。

和其它許多腫瘤一樣，乳腺癌具有遺傳異質性，這就提示我們可以通過分析乳腺癌相關標記物的表達并輔助應用CD-DST技術來建立個體化治療方案。Ki67是一種與細胞增殖有關的核抗原，Ki67標記指數高的患者淋巴結轉移率高，無瘤緩解期和存活時間短，與乳腺癌組織學分級、核分裂指數和淋巴結轉移的情況密切相關。研究者利用CD-DST技術檢測Ki67的表達與藥敏性之間的關系，結果顯示Ki67表達較高的乳腺癌患者對紫杉醇（paclitaxel，PTX）的藥敏性也相應增高［14］。多二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly ADP-ribose poly merase-1，PARP1）是一種DNA修復酶，最新的一項研究中指出，細胞核內PARP1的表達量可以作為預測乳腺癌細胞對化療藥物敏感性的指標［15］。研究發現，在CD-DST技術的指導下，乳腺癌細胞核內PARP1的高表達和癌細胞對紫杉醇與表柔比星敏感性的升高呈正相關，那些核內高表達PARP1的乳腺癌細胞對以蒽環類抗生素聯合紫杉醇類藥物為基礎的化療更敏感［15］。由此看來，CDDST技術是推動乳腺癌個體化化療的又一有效技術，它以顯著的優點加速了其在臨床研究中的應用。

2．3胃癌

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，目前是世界上第四大癌癥，發病率和死亡率均很高，每年大約有93．3萬新發病例，約70萬人死于胃癌［16］。胃癌早期癥狀不明顯，部分患者僅出現消化道疾病的常見癥狀，發現時多已是晚期，手術常常只能達到緩解病情和短暫延長生存而達不到根治的效果，所以晚期胃癌的化療就顯得尤為重要。目前臨床上影響化療藥物對胃癌的治療效果的因素主要是多耐藥性，而隨著近些年興起的CD-DST技術在胃癌中的應用，將有望改善這一現狀并進一步推動建立胃癌的個體化治療方案。有國內學者對CDDST技術在胃癌中的應用進行了多項研究，結果提示P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、血漿谷胱甘肽S轉移酶（glutathione-S-transferase π，GST-π）及TS三種酶的表達與胃癌多耐藥性的形成有關，前兩者和耐藥性呈正相關，而TS酶與耐藥性呈負相關［17］。在為胃癌患者篩選化療藥物時如果輔助以檢測以上耐藥相關分子的表達情況，可以更準確地篩選到有效的藥物。CD-DST技術可以預測單獨用藥和聯合用藥對于胃癌患者的治療效果。一項研究針對晚期胃癌患者的分層Ⅱ期臨床試驗中，應用CD-DST技術檢測3種化療方案對患者的體外效果并與體內療效進行對比，結果顯示體外敏感組的患者生存率明顯高于體外耐藥組，這進一步說明了CD-DST技術能較好地預測晚期胃癌患者對化療藥物的敏感性［18］。表明不同分化時期以及不同轉移部位的胃癌細胞對化療藥物的敏感性有差異，應用CD-DST技術能更精準地檢測其差異性。有學者利用CD-DST檢測技術時發現不同分化程度的腫瘤細胞對于不同藥物的敏感性不同，其中順鉑、奧沙利鉑、5-FU對MGC-830、BGC-823、SGC-7901三種胃癌中分化細胞株的增殖均有顯著的抑制作用，絲裂霉素僅對SGC-7901細胞有抑制作用，且試驗結果測出的相關敏感度數值與臨床數據基本一致，這就提示CD-DST的檢測結果可以有效預測體內藥物敏感度［19］。CDDST技術本身是一種體外藥敏檢測技術，盡管該技術模擬的腫瘤細胞生長微環境相較其他技術更接近體內情況，但差異仍難避免，故其結果須與臨床數據相結合方可得出更加準確的結論。相信隨著CD-DST在胃癌治療中的應用越來越廣泛，將對胃癌患者的個體化治療產生更為積極的推動作用。

2．4胰腺癌

胰腺癌是一種惡性消化系統腫瘤。據統計，近些年全世界范圍內的胰腺癌患者的死亡率由2．2／10萬上升到10．5／10萬［20］。胰腺癌惡性程度高，手術切除率僅10%，化療是胰腺癌的主要治療手段之一，但其單獨用藥或聯合化療的有效率很低。胰腺癌的化療效果很差與腫瘤的個體差異性、多重耐藥性（原發性、繼發性）等因素有關，選擇個體敏感藥物進行個性化治療是提高治療成功率的關鍵。由于CD-DST技術中的膠原能抑制成纖維細胞的生長，且通過染色和圖像分析技術可以很好地排除成纖維細胞對結果的干擾，因此非常適合于胰腺癌這種間質細胞成分多的腫瘤的體外化療藥物敏感性檢測［21］。CD-DST技術在胰腺癌中的應用研究與其它類型的腫瘤相類似。CD-DST技術在胰腺癌中的應用主要集中于各種化療藥物針對腫瘤細胞的敏感性預測上，尤其是一線化療藥物，如5-FU、順鉑（cis-diamine dichloroplatinum，CDDP）、絲裂霉素（mitomycin c，MMC）。有報道稱，一位患有胰腺實性假乳頭狀瘤（solid pseudopapillary tumor，SPT）的患者在進行了末梢胰切除術4年后病情復發，在應用CD-DST技術篩選出敏感藥物的基礎上進行治療后，患者在第二次術后的1．5年中保持健康，沒有發現腫瘤復發的跡象［22］。CDDST技術在胰腺癌中的應用方向也隨著更加廣泛的應用在不斷擴展中。徐強［23］在2009年關于CDDST技術在胰腺癌中的應用研究中發現，胰腺癌細胞原代培養到一定程度時，成纖維細胞的生長開始占優勢，最后腫瘤細胞被纖維類細胞包裹，這可能在體外模擬了胰腺癌硬癌的形成過程。令人更感興趣的是，研究人員還在纖維細胞中發現了星狀細胞的存在，這種細胞是胰腺癌細胞的“幫兇”，能促進胰腺細胞的纖維化［23］。進一步說明了CD-DST技術所營造的細胞生長微環境與胰腺癌細胞在體內的環境擬合度較高，同時也為CD-DST技術在胰腺癌乃至其它腫瘤的研究應用提供一個新思路，即模擬腫瘤細胞在體外生長過程中的病理及生化改變。

2．5非小細胞型肺癌

非小細胞肺癌患者約占所有類型肺癌患者的80%，其中約75%的人被發現時已處于中晚期［24］。非小細胞肺癌目前主要的治療手段是化療，紫杉烷類化合物以及順鉑是治療非小細胞肺癌關鍵的化療藥物。然而，非小細胞肺癌患者對這些化療藥物的敏感性并不清楚，因此，需要一項能夠指導非小細胞肺癌患者用藥的技術，從而減小無效用藥的概率，CD-DST技術應其所需。考慮到體內外藥物作用效果的差異，需要先驗證CD-DST技術的臨床關聯性。就非小細胞型肺癌而言，在CD-DST技術指導下的化療結果中，預測化療反應的準確率約為70%，且對于淋巴結復發轉移的非小細胞肺癌的準確率更高，達到了86%［25］。CD-DST技術的臨床關聯性較好，可以在臨床通過預測回應率和藥物有效率來指導非小細胞肺癌患者選擇化療藥物，使用CD-DST技術選取的化療藥物可以延長非小細胞型肺癌患者的生存時間及提高患者的生存質量。

對于無法采取切除手術的非小細胞肺癌患者，CD-DST技術可以為他們選擇化療藥物，選擇成功率約為61%，使用了由CD-DST技術篩選的化療藥物后，患者的臨床回應率約為70%［26］。同樣，對已切除癌變部位的非小細胞肺癌患者，CDDST技術也可用于幫助患者選擇合適藥物以防止術后復發，提高臨床手術的效果［27］。CD-DST技術給非小細胞肺癌患者提供了更佳的個體化治療，但此項技術在該型癌癥方面的應用尚未成熟，其在非小細胞肺癌中的應用也有局限，對已發生轉移的非小細胞肺癌患者，CD-DST技術有效率較低，如骨轉移和胸膜轉移，其檢測結果與臨床反應關聯不大，這意味著，對于某些抗癌藥物，癌轉移的路線和位置可能會影響CD-DST技術的預測效果［28］。

2．6CD-DST技術在其它腫瘤中的研究進展

CD-DST除了在以上提到的腫瘤的臨床研究有應用之外，還在其它很多腫瘤上有所應用，比如卵巢癌、宮頸癌、頭頸鱗癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、惡性胸膜間皮質瘤等。曾有報道稱一例脾臟組織肉瘤患者接受了CD-DST指導下的化療藥物治療，這也是相關病例的首次報道，結果證實治療十分有效［29］。關于黑色素瘤的一項研究表明CD-DST技術可以用于體外評估黑色素瘤對化療藥物敏感性，但少數藥物除外，比如抗黑瘤素，因其為前體藥，須經體內酶的轉化釋放出活性藥物方能發揮藥效，這也指出了CD-DST技術應用的一個限制因素［30］。CD-DST技術在更多腫瘤中的應用還有待進一步實驗探究。

3　總結與展望

目前化療已由傳統的經驗性治療逐步優化為個體化治療，而在其中不可或缺的就是體外藥敏檢測技術，通過這種技術可以前瞻性地指導患者的臨床用藥，對個體化治療方案的建立具有重大的意義。CD-DST技術作為其中新興的先進技術，有著其它技術不可比擬的優勢。CD-DST技術最先由日本學者創立，其后的研究也主要集中在日本，筆者所能查閱到的文獻多數由日本學者提供，而且日本已有公司將該技術產業化。我國的研究開展得較晚，但是發展很迅速，取得了豐碩的研究成果。CD-DST技術的應用研究在腫瘤個體化治療中十分熱門，目前主要應用于預測腫瘤對于各種藥物的化療敏感性，為患者篩選有效的抗癌藥物，另外還可以用于與腫瘤相關的臨床研究、化療藥物的開發等等。CD-DST技術具備的所需細胞少、特異性高等優點，彌補了當前大部分臨床化療藥敏檢測技術的弊端，并且擴大了其在臨床上的應用范圍。大量的國內外臨床試驗均證實了其良好的效果，該技術的應用能指導臨床科學用藥，真正達到個體化治療的目的，提高腫瘤患者的治療效果。不過和傳統方法一樣，CD-DST技術的發展也存在著一些制約，如體外細胞生長環境無法完全模擬腫瘤體內環境，藥物濃度及持續時間受給藥途徑、肝腎功能等各種因素影響而無法完全再現該濃度變化、某些藥物須經代謝轉化或免疫介導發揮作用而體外藥敏試驗無法很好體現等等。對于這些不足之處研究者們已經開始在尋求改進的方法，以讓CD-DST得到更為廣泛的應用，比如上文提到的Immuno-CD-DST技術等。筆者認為，未來CD-DST技術的發展方向應集中于如何更有效地使膠原內的環境盡可能地接近體內腫瘤細胞生長微環境以及將該技術與腫瘤相關分子檢測技術相結合以探究相關分子在腫瘤發生發展中所起的作用等方面。隨著該技術的進一步發展以及對相關理論和技術更深入的研究，體外模擬的細胞生長環境會和體內更加接近，這將使CD-DST技術的臨床應用更加廣泛?？偠灾?，CD-DST技術已經被國內外醫學工作者廣泛認同，并且隨之在臨床應用的逐步深入及不斷改進，該技術將會在指導個體化治療方案的建立以及抗癌藥物相互作用的研究和新藥研發等方面得到更進一步的發展應用，對臨床的真正應用起到非常重要的作用。

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?綜述?

Advance of collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test in anticancer chemotherapy：a personalized medicine in cancer treatment

XU Wei, LI Wendi, DENG Tianying, ZHANG Zhigao, DU Hongyan★
(School of Biotechno1ogy, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515)

[ABSTRACT]The drug sensitivity of tumor cells is one of the critical issues to conduct individualized therapy for cancer patients. One of the therapeutic approaches is in vitro anticancer drug sensitivity test. Collagen gel droplet-embedded culture-drug sensitive test (CD-DST) is one of the best chemosensitivity tests, and is apparently superior to other methods currently available, because it requires a low number of the cells, has a short turn-around time and involves a simple and easy procedure. Since its establishment, CD-DST has been extensively applied and evaluated in clinical studies for the treatment of malignant tumors. It has been demonstrated that the chemotherapeutic protocols designed according to the results of CD-DST shows a high degree of fitting to the clinical scenario with high therapeutic efficacy and remission rate. CD-DST, as a guideline for the therapeutic decision making, is indispensable in individualized chemotherapy for cancer patients, and it may achieve more extensive clinical application with advance of new techniques. In this article, we review the establishment and advance of CD-DST, hoping to provide some basis for the future study.

[KEY WORDS]Chemosensitivity assay in vitro; Tumor; CD-DST; Chemotherapy

通訊作者：★杜紅延，E-mail：gzduhongyan＠126．com

基金項目：國家教育部博士點基金（20134433120020）；國家自然科學基金（81401920）；南方醫科大學基礎研究前期啟動項目（QD2013N005）