單基因遺傳病基因診斷技術研究進展

郭奕斌　梁宇靜　郭東煒

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單基因遺傳病基因診斷技術研究進展

郭奕斌1★梁宇靜2郭東煒3

［摘要］單基因遺傳?。ê喎Q單基因?。┓N類、分型繁多，常規診斷難以確診，而基因診斷技術在遺傳病特別是單基因病的確診、分型等方面都發揮著不可或缺的作用。近一、二十年來，基因診斷技術進展迅猛，各種檢測方法層出不窮。本文重點圍繞基因診斷技術的最新進展進行綜述，以期對臨床診斷和預防工作提供一些有益的啟示。

［關鍵詞］單基因??；基因診斷；技術方法

作者單位：1．中山大學中山醫學院醫學遺傳學教研室，廣東，廣州510080

2．中山大學醫學遺傳室業余科研小組／2011級臨床醫學專業，廣東，廣州510080

3．廈門大學醫學院2014級臨床醫學專業，福建，廈門361102

在5大類遺傳?。郯▎位蜻z傳病（簡稱單基因?。?、多基因病、染色體病、線粒體病和體細胞遺傳?。葜校》N最多的當屬單基因病［1－3］。據在線人類孟德爾遺傳最新報道，已被美國國家生物技術信息中心正式收錄的就有22 000多種［3］。

對于基因病，基因診斷被公認是確診該類疾病最準確、最可靠的診斷技術和金標準，它可以在分子水平甚至在單個堿基發生改變的情況下作出明確診斷?；蛟\斷是繼形態學、生物化學和免疫診斷學之后的第四代診斷技術，是診斷學領域的一次革命［4］。它打破常規診斷的方式，不以疾病的表型為主要依據，而是采用分子生物學的技術和方法，直接檢測被檢者某一特定基因的結構或者功能是否異常，從而對疾病作出診斷。相對于常規診斷，基因診斷更注重個體基因狀態，不僅可以對患者所患疾病做出判斷，還可以對表型正常的攜帶者或者遺傳易感者做出前瞻性診斷［4－5］?；蛟\斷具有高特異性、高靈敏性、早期診斷性和應用廣泛性等特點，因此日益得到普及和推廣。近一、二十年來，基因診斷技術取得了前所未有的進步。隨著該技術在臨床檢測中的推廣、應用，其已為早期診斷單基因病、多基因病以及腫瘤遺傳病、線粒體遺傳病等帶來了曙光。回顧基因診斷的發展歷程，不難看出，它經歷了從間接診斷到直接診斷，從簡單到復雜再回歸簡單，從單一技術到整合技術，從時間長、成本高、通量低、需手工操作到快速、廉價、高通量、自動化，從多細胞到單分子，從用量多到用量少的過程［6］。下面重點對單基因病的最新基因診斷技術做一概述。

1　基因診斷技術分類

基因診斷通常在基因定位、基因克隆、基因序列、蛋白結構已經弄清或雖未弄清但與其他遺傳標記的連鎖關系已經明確的情況下進行，大致分為間接診斷和直接診斷2大類。

從發展歷程和診斷策略來看，基因診斷技術包括：（1）連鎖分析類：限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、可變數目串聯重復（variable number of tandem repeat，VNTR）、短串聯重復（short tandem repeat，STR）、簡單序列長度多態性（simple sequence length polymorphism，SSLP）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，Amp－FLP）、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）；（2）分子雜交類：Southern印跡雜交（Southern blot）、斑點雜交（dot blot）、反向點雜交（reverse dot blot，RDB）、Northern印跡雜交（northern blot）、蛋白質印跡雜交（western blot）、抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）；（3）PCR及其衍生技術類：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、不對稱PCR（asymmetric PCR）、多重PCR （multiplex PCR）、多重巢式PCR（multiplex-nested PCR）、長片段PCR（long PCR）、三引物PCR（triprimer PCR，TP-PCR）、逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）、實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RTQ-PCR或qPCR）、數字PCR技術（digital PCR，dPCR）、PCR寡核苷酸探針雜交（sequence-specific oligonucleotide primed PCR，PCR-SSO）、擴增阻礙突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）［即等位基因特異性擴增（allele-specific amplification，ASA）］、高分辨熔解曲線分析（high-resolution melting curve analysis，HRM）、多重連接探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）、變性高效液相色譜分析（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC）、DNA生物傳感器檢測法（DNA biosensors）；（4）基因芯片（DNA chip）技術：cDNA芯片、寡核苷酸芯片等；（5）基因序列分析類：Sanger法測序、高通量測序技術（high-throughput sequencing）［即下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）］、基因組擴增轉錄同步測序法（genomic amplification with transcript sequencing，GAWTS）、全外顯子測序（whole-exome sequencing，WES）［即外顯子組測序（exome sequencing）］、全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）、第三代測序技術等數十種。隨著科學技術的飛速發展，基因診斷和各種組學的新技術新方法也在不斷涌現并日益在臨床醫學中發揮著重要的作用。

2　間接診斷

間接診斷是指當致病基因本身尚屬未知或致病基因雖然已知但其突變尚屬未知時，可以通過對患者及其家系成員進行連鎖分析或單倍型分析，從而推斷受檢者是否帶有致病基因的一種診斷方法。

連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標記通常會一起傳遞給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，即可間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態性位點，特別是基因突變部位或緊鄰的多態性位點作為遺傳標記。RFLP、SSLP、STR、SNP等均可用于連鎖分析。通過多位點的連鎖分析，還可進行親子鑒定等。通常，RFLP被認為是第一代遺傳標記，SSLP／STR是第二代遺傳標記，SNP是第三代遺傳標記［7］。

3　直接診斷

對于基因序列、結構、功能、突變類型都清楚的、且發生于候選基因內的突變的檢測，可以采用直接診斷的方法。直接診斷是指直接檢查目的基因本身有無異常。它通常是用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產物，以探查基因有無突變、缺失等異常并闡明突變的性質和突變的類型等。直接診斷適用于已知基因異常的疾病。下面分別介紹。

3．1分子雜交及相關技術

互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即所謂的分子雜交。分子雜交技術包括Southern blot、northern blot、dot blot、RDB、SSH、DNA biosensors、western blot等。其中，Southern blot、northern blot和dot blot、RDB、SSH、DNA biosensors也稱核酸的分子雜交，用于檢測特定的DNA、RNA；western blot又稱免疫學測定，用于檢測特定的蛋白質。核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一，其中，SSH技術、DNA生物傳感器檢測法比較新穎，本節重點介紹它們。

3．1．1SSH技術

SSH技術是一種鑒定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術，是一種以抑制性PCR（利用鏈內退火優于鏈間退火，使非目的序列片段兩端的長反向重復序列在退火時產生“鍋柄樣”結構，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列片段擴增）反應為基礎，將標準化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。它是建立在抑制性雜交和選擇性PCR基礎上的差異表達基因篩選手段。通過合成2個不同的接頭，接于經限制性內切酶消化后的測試cDNA片段的5′末端，將測試和驅動進行兩輪雜交［8－9］。

該技術具有篩選高效、假陽性率低的優點，因而廣泛應用在動物、植物、人類及癌癥等研究領域［5］。在高血糖發病的研究中，研究者利用SSH方法發現丙酮酸羧激酶和膽固醇O-乙?；D移酶2個基因與葡萄糖激酶代謝緊密相關，并利用RTQPCR對其進行了驗證［10］；在進行葡萄糖激酶對腎臟功能影響研究時篩選到谷胱甘肽過氧化物酶3 （glutathione peroxidase-3，GPX3）基因表達發生改變，并且GPX3可作為腎臟損傷初期的標記物［11］。Ren等［12］利用SSH方法鑒定出旋毛蟲肌肉期幼蟲與腸道期幼蟲的9個差異表達基因（Ts7、Ts8、Ts11、Ts17、Ts19、Ts22、Ts23、Ts26、Ts33），對旋毛蟲肌肉期幼蟲轉變成腸道期幼蟲的相關機理進行了闡述。曹振龍等［9］利用SSH方法對小鼠MOE內受AC3調控的差異表達基因進行了篩選，獲得了kcnk3、mapk7、megf11、c-mip、skp1a、mlycd、tmem88b、trappc5、ppat、ssr3等差異表達基因，并證實這些基因分別與K＋通道、胞外信號調控、胞內蛋白泛素化因子、胞內蛋白轉膜與運輸等生物學功能相關。SSH法所需實驗材料是通過PCR擴增獲得，整個過程包括多次酚：氯仿抽提，這些過程可能會使部分基因丟失，此為其不足之處。

3．1．2DNA biosensors技術

3．2PCR及其衍生技術

對于基因突變的檢測，在1985以前主要是利用Southern印跡法，它可以檢出基因的缺失、插入、重組等突變形式，而點突變、微缺失、微插入則很難檢出，只能應用PCR結合其他方法完成。PCR技術是突變研究中的重大進展，目前幾乎所有的基因突變檢測技術都是建立在PCR基礎之上，并且由PCR衍生出許多新方法，目前已達20余種，自動化程度也越來越高，分析時間也大大縮短，分析結果的準確性也有很大提高。這是因為PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的1．5 h～3 h內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素來提高其敏感性，而通過擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷現可以縮短至數小時甚至1 h～2 h。

PCR技術目前有許多新的發展，用途日益擴大。本小節重點介紹TP-PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR這幾種。

3．2．1TP-PCR技術

TP-PCR是一種不需要限制性內切酶和連接酶的重組DNA的方法?？捎糜谄唇尤诤匣?；目的基因中堿基的定點突變；目的基因中某些功能結構域的人工缺失研究；在目的基因中的任何位置插入外源基因片段，進行重組基因的研究。

該法的原理是：TP-PCR反應體系中有2種模板和3種引物，可以在同一個反應體系中產生一個重組DNA分子。設計合理的中間引物是保證TPPCR反應成功的關鍵。只有中間引物設計合理才能保證2種DNA片段在融合位點正確連接。3條引物的濃度比例是另一個關鍵因素。要適當調節中間引物的比例使得TP-PCR反應獲得最理想的結果。實驗結果表明，合適的比例范圍可有效增加目的片段的擴增，同時減少非特異產物的擴增，一般來說在1／1 000～1／100范圍內比較合適。除此之外，為了保證PCR產物的高忠實性，需用高忠實的DNA聚合酶來代替Taq聚合酶［14－15］。

TP-PCR法簡便、快捷、經濟，可以在所期望的任何位點將2種DNA片段連接起來，而無需知道DNA片段的限制位點。通過TP-PCR進行重組操作，可以在幾個小時內于一個PCR反應體系中完成，無需高檔設備儀器和試劑盒，即可實現對所研究的目的基因的改造。鄧朝陽等［14］用這種方法構建融合蛋白基因——SCK基因獲得成功。朱艷等［15］用該法構建抗人CD28嵌合抗體雙啟動子昆蟲桿狀病毒重組轉移載體也獲得圓滿成功。該法的突出優點在于無需設計外源的DNA序列，即可實現對目的基因的任何常規性改造，從而避免在原有基因中引入冗余的酶切位點的堿基序列［14－16］。

另外，品牌建設是當前農產品附加值提升的一個重要影響因素，品牌建設不可忽視。企業應該加大資金投入，增強湖北特色農產品品牌營銷與推廣力度，創新品牌建設方式，與時俱進，進行多形式的營銷推廣活動，擴大品牌在國內國際的影響力，提高企業知名度，發揮品牌效應，以品牌帶動消費，擴大市場；以市場需求促進產品價格提升，形成良性循環。

3．2．2RT-PCR，RTQ-PCR和多重巢式RT-PCR技術

RT-PCR為逆轉錄PCR（reverse transcription PCR）的縮寫。逆轉錄PCR是PCR的一種衍生技術。在逆轉錄PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為cDNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量檢測某種RNA的含量。

RT-PCR有時候也會指代實時PCR（real time PCR）。為了與逆轉錄PCR相區別，通常被寫作實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RTQPCR）［17］。實時PCR，屬于定量PCR的一種，以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。

多重巢式RT-PCR的原理同多重巢式PCR，不同之處在于所用的模板是cDNA而不是DNA。逆轉錄PCR可在RNA水平檢測基因的突變類型和突變效應。實時熒光定量PCR具有靈敏、特異、技術成熟和操作簡便等優點，對于臨床上明確診斷、具體分型、動態觀測腫瘤負荷、選擇合適治療方案、評估治療效果和預后都有較大價值。在產前監測和產前基因診斷也具有重要意義。

逆轉錄PCR（RT-PCR）和多重巢式RT-PCR有一個共同的缺點就是所提的RNA易降解且操作較繁瑣。

3．2．3dPCR技術

dPCR技術是一種新的核酸檢測和定量技術，與傳統qPCR（即RTQ-PCR）技術不同，dPCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數。由于這種檢測方式具有比qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，故得到廣泛的應用。這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面都具有諸多優勢，其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面也具有廣闊的應用前景。

該技術是采用“分而治之”（divide and conquer）的策略，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子（DNA模板），實現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。

dPCR是PCR領域最激動人心的創新之一，該技術可應用于單細胞分析、罕見腫瘤等位基因檢測、產前診斷以及血液中游離腫瘤DNA、表觀遺傳學直接相關的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等眾多領域［18－32］。如果將PCR技術進行分代的話，那么第一代PCR技術就是我們目前最常用的常規PCR了，它可通過凝膠電泳獲得定性結果。而曾經風靡全球的RTQ-PCR可稱為第二代PCR技術，它利用熒光試劑監控擴增，來實現相對定量，在開展基因表達分析時，需要標準曲線或參考基因來協助定量。而dPCR則可謂是第三代PCR技術，它不再依賴Cq值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，它是一種核酸分子絕對定量技術，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于一個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。它比RTQ-PCR更加靈敏、特異、精確，故日益得到廣泛的應用?？蓱糜冢喊┌Y生物標志物研究和拷貝數變異分析；病原體檢測；與NGS無縫對接，對二代測序結果進行驗證；miRNA表達分析；單細胞基因表達分析；環境監測；食品檢測［18－32］。Floren等［28］用dPCR法成功對肉類及肉制品進行了品種鑒定和量化。日本科學家Miyake等［33］2013年對一對患有雷特氏綜合癥（rett syndrome，RTT）的同卵雙生雙胞胎進行了基因組學以及表觀遺傳學的研究。文章對該雙胞胎姐妹（其中一個為非典型RTT，另一個為典型RTT）采用了第一代毛細管測序，二代測序、SNP 和CNV芯片、基因組DNA甲基化芯片、RTQ-PCR以及dPCR等分析方法，得出結論：是表觀遺傳學水平上而非基因組水平上的差異，導致了兩姐妹不同的臨床表現。表觀遺傳學上的差異也許主要源自X染色體失活。在對雙胞胎姐妹的CNV位點是否相同進行確認時，Miyake等首先采用CNV芯片的方法刪除8 195個位點的不同；然后采用NGS進一步確認，發現其中僅有29個CNV位點可能存在差異；使用更加準確的dPCR平臺后，發現在這對姐妹中沒有存在CNV位點的差異，就遺傳背景而言兩者完全一致。在討論部分中，作者特別指出：需要對采用芯片或NGS得到的SNP／CNV位點的相關數據采用進一步定量的分析。這篇文章正是采用了dPCR法進行驗證，并進一步糾正了NGS的錯誤數據。

3．3PCR基礎上的基因突變檢測技術

3．3．1擴增阻礙突變系統／限制性核酸內切酶（amplification refractory mutation system／restriction endonuclease，ARMS／RE）技術

ARMS／RE雙重鑒定法特別適用于種植前基因診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）等需快速特異、準確靈敏檢測的項目。此法是將ARMS［34－35］與RE巧妙結合，在設計3′端錯配堿基的特異引物的同時引入酶切位點。有時一個堿基的錯配不一定含有酶切位點，這時可根據限制酶的識別序列，人為設計成雙錯配甚至三錯配。

ARMS／RE將ARMS法和RE法合二為一，具有雙重鑒定的效能，即首先用ARMS法鑒定一次，然后再用RE法鑒定一次，故可大大提高鑒定的準確率。中山大學中山醫學院醫學遺傳學教研室曾用該法用于軟骨發育不全的PGD研究并獲得成功［36］。但該法也有不足，其不足是往往需要花費很多時間人為錯配堿基才能找到酶切位點，且所用的內切酶多數較罕見，成本較高，且酶易失活，保存期有限。

3．3．2DHPLC技術

DHPLC是一種高通量篩選DNA序列變異的技術，主要用來分析異質性雙鏈結構：（1）在不變性的溫度條件下，檢測并分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態性的片段；（2）在完全變性溫度條件下，可以區分單鏈DNA或RNA分子，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質量控制；（3）在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產物經過變性復性過程，不僅分別形成同源雙鏈，同時也錯配形成異源雙鏈，根據柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識別變異型［37－38］。

該技術可進行基因突變檢測、SNP分析等方面的研究；可檢測出含有單個堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段；快速高效無毒經濟；除了檢測已知突變還能檢測未知突變；自動化程度高；其敏感性和特異性可達90%以上，明顯高于單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）檢測技術。但該技術不能檢測純合突變，檢測純合突變需在PCR產物中加入野生型擴增產物；不能確定突變的具體位點，也不能確定是哪種突變類型；儀器價格高，分離柱有一定的使用壽命，需定時更換；目前僅用于檢測200 bp～500 bp大小的DNA片段；引物二聚體、非特異擴增產物以及與樣品堿基數類似的污染產物將會影響分析，需通過優化PCR去除之；PCR產物濃度必須足夠大，否則會導致信噪比下降，分析結果的可靠性也會隨之下降［37－38］。

3．3．3HRM技術

HRM主要用于未知突變篩查。根據目標DNA序列的長度、GC含量及堿基的互補性差異，利用HRM對樣品的基因型進行分析，其分辨精度可達單個堿基的差異。由于每一段DNA都有其獨特的序列，因而在加熱變性時就會有獨特的溶解曲線形狀，它可以通過DNA分子緩慢升溫過程中飽和熒光染料熒光值的變化而得到具體顯現。如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩定性和可重復性。根據它們獨特的溶解曲線，即突變片段與野生型片段熔解曲線的形狀和位置存在差異，就可以對不同的核酸片段進行區分［39］。

該法在突變篩查中其便捷性、靈敏性與特異性均優于DHPLC，并且檢測成本較低，耗時較少，是近年來發展起來的核酸分析技術。靈敏快速無毒高效，對已知和未知的突變都可檢測。但和DHPLC一樣，不能準確檢測具體突變［39］。

3．3．4MLPA技術

針對基因內每個待檢區域設計一對DNA探針。每個MLPA探針包括2個熒光標記的寡核苷酸片段，一段引物序列和一段特異性雜交序列。在MLPA反應中，2個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交，之后使用連接酶連接2部分探針。連接反應高度特異，只有當2個探針與靶序列特異性序列完全互補，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個堿基的差別，連接反應也無法進行。連接反應完成后，用一對通用引物擴增連接好的探針，每個探針擴增產物的長度都是唯一的，范圍在130 bp～480 bp。最后，通過毛細管電泳分離擴增產物，收集數據，軟件分析，得出結論。只有當連接反應完成，才能進行隨后PCR擴增并收集到相應探針的擴增峰，如果檢測的靶序列發生點突變或缺失、重復突變，那么相應探針擴增峰便會缺失、降低或增加，根據擴增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數的異?；螯c突變存在［40－41］。

該法高效、特異，在一個PCR反應中可以同時擴增數十個探針的連接產物，可用40對～50對特異探針，一次性檢測40種～50種突變類型，可以檢測45個核苷酸序列拷貝數的改變，實現了高通量的缺失檢測。同時該技術所具有的相對定量能力還能對基因的重復進行判斷。近年來，MLPA在技術與應用上又有許多新的發展，如運用化學合成法制備3′、5′探針，在基因甲基化檢測、基因表達水平分析、基因部分片段重復區域拷貝數分析及轉基因基因分型中獲得廣泛應用，加上MLPA與基因芯片微陣列技術的結合，使得多重連接探針擴增真正具備了高通量檢測能力［41］。但該法需要毛細管電泳裝置，試劑盒價格較高；只能檢測已知突變。

3．3．5蛋白截短測試法（protein truncation test，PTT）

本方法是從蛋白質水平的變化來檢測基因突變，它主要檢測導致開放閱讀框架改變的堿基缺失或插入突變等。檢測時須提取細胞mRNA，將待測靶基因逆轉錄為cDNA，所用逆轉錄引物含一段T7啟動子和真核細胞翻譯起始序列，逆轉錄產物在無細胞提取液中翻譯為相應的蛋白質。如果基因突變導致了開放閱讀框架的改變，那么合成的蛋白質經SDS-PAGE分離時會出現比正常蛋白質或長或短的蛋白產物［42－43］。

本法突變檢出率高，一次可處理大量的樣品，并可檢測4～5 kb片段的突變。但不能檢測不影響開放閱讀框架的突變，且需要抽提組織mRNA。另外，移碼突變如果太靠近基因的5′端或3′端，用聚丙烯酰胺凝膠電泳也無法檢測出，由差異剪切所形成的異構體也會影響結果的分析。

3．4DNA chip技術

用于檢測已知突變，是90年代后發展的一項DNA分析新技術。按應用的不同，基因芯片可分為：基因表達譜芯片和寡核苷酸芯片。按核酸探針的不同，可分為：寡核苷酸芯片和cDNA芯片。按介質的不同，可分為：玻璃片、硅片、尼龍膜、陶瓷和微型磁珠等。按用途的不同，可分為：表達譜芯片、診斷芯片、測序芯片、毒理芯片和指紋圖譜芯片等。按點樣方法的不同，可分為光刻基因芯片、機械微型點樣基因芯片、液體噴射技術基因芯片等。按制備方法的不同，可分為：原位合成和直接點樣［38］。基因芯片技術集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標記探針和DNA合成等先進技術，可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構建等。在基因突變檢測方面也有廣闊的前景。DNA芯片技術將生物技術和信息技術有機結合，是今后基因診斷的發展方向和趨勢［44－46］。

該技術檢測信息高通量，自動化程度高，一次可檢測眾多突變位點，具有很大的發展潛力，將在基因突變檢測中發揮非常重要的作用，可用于疾病臨床早期診斷和批量篩選，確定疾病亞型和選擇最佳治療方案；也可用于耐藥基因的篩選以及新藥的研發。PCR核酸診斷技術雖經典，但難以滿足現今檢驗、檢疫需求，而“微流控芯片技術”既含蓋微流體操作系統又滿足實驗結果的分析功能。由于芯片“實驗室”排污很少，故被稱作是一種“綠色”技術［45－46］。芯片技術雖然優點眾多，但成本高，技術含量高，目前普及推廣還有一定難度。

3．5 DNA序列分析技術

DNA序列分析是一種非常重要的基因診斷技術，被稱為是基因診斷的金標準。近10年來發展非常迅速，從第一代Sanger法測序開始，經歷第二代的高通量測序技術，至今已發展到第三代——單細胞測序技術。

關于1代～3代測序技術的原理、優缺點、在基因診斷中的應用以及3代測序技術特點的比較，詳見文獻［6］，本文不再贅述。

4　小結與展望

隨著醫學技術的不斷發展，憑借人體基因密碼預測相關疾病的風險性和發展進程，做到早檢測、早預防、早治療，基因診斷技術在臨床的應用將有更加廣闊的前景。展望未來，我們可以預見：（1）染色體水平與基因水平的檢測將結合得更加緊密；（2）高通量、自動化、低成本獲得更大發展；（3）PCR技術將以優化反應和拓展應用為主，隨著反應速度、延伸范圍和檢測成本的不斷優化，PCR技術將繼續引領現代分子生物學的發展；（4）無創性產檢將相當普及，PGD也將進入到一個更普及的階段；（5）群體篩查的項目將更多，技術手段將更高、更快捷、更準確；（6）隨著儀器成本的降低、小型化，試劑、試劑盒的大量研發，個體化、自主化檢測程度將更加提高；（7）臨床與基礎研究結合將更加密切，研究成果將更加及時應用于臨床診防治，轉化醫學得到充分體現；（8）每個人一生的生老病死有望在胚胎早期就被解讀、破譯，疾病的預防有望得到更早期、更有效的控制；（9）可以為基因治療尋找更多新的治療靶點，從而促進基因治療的迅猛發展。

參考文獻

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?綜述?

Research advance in genetic diagnosis of monogenic inherited diseases

GUO Yibin1★, LIANG Yujing2, GUO Dongwei3
(1. Department of Medical Genetics, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China, 510080; 2. Amateur Team, Department of Medical Genetics, Clinical Medicine (Grade 2011), Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China, 510080; 3. Clinical Medicine (Grade 2014), Medical College, Xiamen University, Xiamen, Fujian, China, 361102)

［ABSTRACT］Monogenic diseases are caused by inheritance of single mutated gene, but the type of the diseases are diversified depending on the type and locus of genetic mutation inherited. While conventional laboratory methods may contribute to an initial identification, a definitive diagnosis and classification of these inherited disorders often need molecular/genetic testing. In the past twenty years, diagnostic techniques for the genetic disorders have rapidly advanced, leading to the invention of many laboratory tests for the detection of genetic disorders. In this article, we review the recent advance in the diagnostic modalities for the genetic disorders, in hope of setting light on improvement of the clinical diagnosis and prevention.

[KEY WORDS]Monogenic disease; Gene diagnosis; Technology and method

通訊作者：★郭奕斌，E-mail：aguoabin＠qq．com

基金項目：國家自然科學基金（30772069）；閩粵橫向科研基金（71010025）