單細胞轉錄組測序的方法原理及應用

朱翔　浦春　武其文

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單細胞轉錄組測序的方法原理及應用

朱翔浦春★武其文

［摘要］常規的轉錄組分析方法通常需要103個細胞，所以無法揭示單個細胞之間基因表達的異質性，也難以對諸如早期胚胎及異質性的組織干細胞和腫瘤干細胞等極少量細胞進行分析，而單細胞轉錄組測序技術的出現為此提供了有效的研究工具。單細胞轉錄組測序技術是在單細胞水平對全轉錄組進行擴增與測序的一項新技術。本文主要就單細胞轉錄組測序技術的操作方法、應用成果以及進展作一綜述。

［關鍵詞］轉錄組；單細胞分離；高通量測序；全基因組擴增

作者單位：皖南醫學院第一附屬醫院檢驗科，安徽，蕪湖241001

Principle and application of single cell transcriptome analysis

ZHU Xiang, PU Chun★, WU Qiwen
(Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital, Wannan Medical College, Wuhu, Anhui, China, 241001)

［ABSTRACT］The conventional transcriptome analysis requires minimally 103cells, which makes it hard to identify the heterogeneity of gene expression among individual cells, or difficult to evaluate the specimens with very limited number of cells, such as early embryos, heterogeneous tissue specific stem cells and tumor stem cells. However, the emerging of single cell transcriptome analysis provides an efficient tool to achieve such research purposes. The single cell transcriptome sequencing technique is a new strategy to amplify and sequence the whole transcriptome in single cell. In this article, we review the development, relevant operating procedures, and applications of single cell transcriptome sequencing technique.

［KEY WORDS］Transcriptome; Single cell isolation; High-throughput sequencing; Whole genome amplification

在過去的二三十年里，基因組測序技術快速發展，人類千人基因組計劃和癌癥基因組計劃等大型測序項目相繼開展。這些測序所使用的材料均為數百萬個細胞的混合樣本，雖能夠得到為全基因組序列信息，但其結果顯示的只是一群細胞中信號的平均值，或只代表其中占優勢數量的細胞信息，對單個細胞間的差異卻被忽視。對同一組織眾多細胞的測序會生成多重數據，不利于追蹤細胞病變過程和細胞間狀態差異。

對臨床上諸如循環腫瘤細胞、早期發育的胚胎細胞等含量稀少的細胞而言，混合細胞群樣本的測序方法也已不再適用。2006年，Zhang在“Nature Biotechnology”上發表文章最先提出單細胞基因組測序技術［1］，即在單個細胞水平對全基因組或轉錄組進行擴增與測序的一項新技術，這在近年取得突飛猛進的發展。本文就單細胞轉錄組測序的技術原理及應用進展作一綜述。

1　單細胞轉錄組測序技術

1．1單細胞轉錄組測序概述

轉錄組是指在某一特定階段，由細胞轉錄出來的全部RNA，包括mRNA和非編碼RNA［2－3］。轉錄組學就是從RNA水平研究基因的表達情況，在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控的規律。與基因組不同，轉錄組學研究包含了時間和空間的限定。同一細胞在不同的生長時期及生長環境下，其基因表達情況是不完全相同的。近幾年興起的單細胞測序技術可以在單細胞水平對全轉錄組進行擴增與測序，其原理是將分離的單個細胞的微量全轉錄組RNA進行擴增后進行高通量測序。利用該技術能夠揭示單個細胞內整體水平的基因表達狀態和基因結構信息，準確反映細胞間的異質性，深入理解其基因型和表型之間的相互關系。單細胞基因組技術已經應用到多個領域，如植物細胞、動物細胞（包括人體細胞）和微生物等。但是，單細胞基因組測序技術仍有3個關鍵技術點：第一，單細胞分離技術；第二，單細胞全基因組擴增技術；第三，高通量測序技術。

1．2單細胞分離技術

進行單細胞轉錄組的測序，首先要對單個細胞進行分離分獲得到單細胞樣品。迄今為止，已經有多種技術方法被用于單細胞的分離，常用的單細胞分離方法主要有連續稀釋法（serial dilution）、顯微操作法（micromanipulation）、熒光流式分選法、激光捕獲顯微切割技術以及微流控平臺（microfluidic platforms）。這些方法各有利弊，所以要根據具體的情況選擇合適的方法進行分離。

1．2．1連續稀釋法

該技術通過將細胞進行一系列的倍比稀釋最終使細胞處于單個狀態，已成功應用在不同組織的干細胞、前體細胞體外克隆形成分析的研究中［1，4－5］。此方法操作簡便，且不需要特殊的設備，但是依賴于梯度稀釋計算，不是直觀的單個細胞分離，容易出現錯誤。

1．2．2顯微操作法

顯微操作法是指在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器（控制顯微注射針在視野中移動的機械裝置）進行細胞或早期胚胎等操作的一種技術方法。此技術主要應用于目標細胞所在的群體數量較少的樣品分離中［6］，能夠高效地控制單個細胞的吸取和釋放。

1．2．3熒光流式分選法

熒光流式分選法是一種通過流式細胞儀，根據細胞特異性分子標志或者細胞光散射的特性，分選單個細胞或者特殊細胞群的技術［7］。此技術主要的優勢在于能夠選擇特異和非特異的分選，并且在分離單細胞時具有很高的精度和通量［8］。

1．2．4激光捕獲顯微切割技術

激光捕獲顯微切割技術［9］是選擇性地將目標組織切片或細胞固定在裝配有可以激光脈沖激活的熱塑膜的涂片上，其中膜包括乙烯乙酸乙烯酯膜、聚對苯二甲酸乙二醇酯膜和聚萘二甲酸乙二醇酯膜等，顯微鏡直視下選擇并激光切割目標細胞。應用此技術可以直觀地在顯微鏡下準確、快速地獲取單一細胞亞群或者單個細胞，解決了組織中細胞異質性的問題。該技術現已廣泛應用于結腸癌［10］、乳腺癌［11］、結核病［12］和丙型肝炎［13］的研究中。

1．2．5微流控平臺

與其他方法比較，微流控平臺相結合單細胞測序技術在降低單細胞測序的噪聲以及基因組擴展更加均勻方面具有優勢，顯示出了良好的應用前景［14－16］。此外，微流體芯片的微量反應容積還提高了擴增的精確率和反應效率。許多實驗室開始設計將微流控平臺用于他們的研究對象［17－18］，并且有微流控平臺已經商品化［19］。例如，Fluidigm公司最近推出一款C1單細胞擴增儀器，其原理就是在微流控芯片中進行細胞裂解、反轉錄與cDNA擴增，再利用轉座酶技術構建測序文庫［20－21］，顯著提升了建庫通量。

1．3單細胞全轉錄組cDNA擴增技術

全基因組擴增是單細胞轉錄組測序的關鍵步驟，對于形成足夠量的DNA片段用于測序分析起著至關重要的作用。如今已研發出多種擴增方法，例如簡并寡核苷酸引物PCR、引物延伸預擴增PCR、連接介導的PCR等。尤其近年發展起來的基于多重置換擴增和多次退火環狀循環擴增單細胞測序，他們在全基因組擴增中有著較為廣泛的應用。

1．3．1多重置換擴增技術

多重置換擴增技術最先由Dean等在2002年報道。多重置換擴增技術作為一種不依賴于PCR的全基因組擴增方法，近些年來得到廣泛應用。該方法利用Phi29DNA聚合酶和隨機六聚體引物對人基因組進行指數擴增，首先隨機六堿基寡核苷酸作為引物在多個位點與基因組模板DNA退火，接下來Phi29DNA聚合酶在多個位點同時開始復制，沿著DNA模板合成DNA，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又作為新的模板來進行擴增，形成一個級聯分支的放大系統，最終可獲得相對高分子質量的DNA。該反應在常溫下擴增，避免了高溫下DNA降解對擴增產物質量的影響及GC含量不同引發的優勢擴增。但是此方法的擴增均勻性不高。多重置換擴增技術可用于單核苷酸多態性以及突變相關的研究。

1．3．2多次退火環狀循環擴增技術

2012年12月，哈佛大學的研究團隊在Science上發表介紹多次退火環狀循環擴增技術的文章［22］，該技術是目前最先進的全基因組擴增技術。不同于以往的擴增方法，多次退火環狀循環擴增能夠從一個細胞的基因組中，分離出來自單細胞的DNA，然后添加特殊的引物，這些引物可與DNA的隨意部分互補，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當DNA復制起點。這些引物由兩個部分構成——一個包含8個核苷酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結合，再加上一個包含27個核苷酸的共同序列。這一共同序列通過將自身摻入到新拷貝鏈，從而自身成環，防止了過度拷貝，從而大大地降低了擴增偏倚，提高了基因組覆蓋率，可以使單細胞中93%的基因組被測序。另外，多次退火環狀循環擴增的靈敏度較高。單細胞、單染色體或0．5 pg的基因組DNA即可進行擴增，擴增的均勻性也顯著優于其它技術。該技術可用于那些樣本稀少，用常規方法無法進行基因組或轉錄組分析或者樣本高度異質，細胞之間存在重要差異的樣本。

1．4高通量測序技術

自2005年以來，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD （supported oligo ligation detetion）技術為標志的高通量測序技術相繼誕生［23－24］。高通量測序技術是測序技術發展的一個里程碑，該技術可以對數百萬個DNA分子進行同時測序，從而使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測序（deep sequencing）或下一代測序技術。Roche公司首先推出了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統。該技術的原理是酶級聯化學發光反應：首先將PCR擴增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、ATP雙磷酸酶、底物熒光素酶和5′－磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測序反應中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸。焦磷酸鹽被硫酸化酶轉化為ATP，ATP就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光。電荷耦合器件檢測后通過軟件轉化為一個峰值，峰值與反應中摻入的核苷酸數目成正比［24］。隨后，Illumina公司和ABI公司也相繼推出了Solexa和SOLiD測序技術。正如高通量測序技術在基因組測序中發揮了強大的作用，它也極大地促進了轉錄組測序的發展。將以上高通量測序技術應用到由RNA逆轉錄生成的cDNA上，就產生了RNA-Seq技術［25］。

2　單細胞轉錄組測序技術的應用

2．1腫瘤和循環腫瘤細胞

2011年，來自冷泉港實驗室的Navin等［26］運用一種單細胞測序，通過基于拷貝數變異的數據結果分析了乳腺癌的癌細胞種群結構，指出腫瘤的進化可能是間斷性的，挑戰了傳統的腫瘤漸進式演化模型。2012年，深圳華大基因研究院將其自主研發的一種解析單細胞基因組的新方法應用于原發性血小板增多癥和腎透明細胞癌的腫瘤內部遺傳特征的研究。此方法解決了之前用組織樣本測序時無法解決的腫瘤高異質性難題，為從單核苷酸水平深入研究癌癥發生、發展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。為了探究腫瘤的演化及遺傳特性，研究人員對取自一例典型的JAK2基因陰性原發性血小板增多癥病人的90個單細胞進行了全外顯子測序［27］，通過分析，研究人員揭示了此原發性血小板增多癥在腫瘤發生中遵循單克隆演化模型，并鑒定了一些與原發性血小板增多癥的發生、發展相關的突變基因。另外，研究人員為了更好地解析腎癌內部的遺傳變異情況，運用此方法對一例腎癌進行了研究［28］。他們發現此例腎癌并非由常見的兩個突變基因VHL和PBRM1導致，說明在病人群體中所鑒定的頻發突變可能與腫瘤個體無關，同時也強調了在癌癥分析和診斷過程中進行個性化治療的重要性。

循環腫瘤細胞是一種從腫瘤原發灶中脫落進入患者血液的腫瘤細胞，數量極為稀少，但與腫瘤的轉移和復發有著密切關系［29］。單細胞轉錄組測序為其轉錄組分析提供了工具。例如Daniel等［30］利用Smart-Seq技術對單個循環系統腫瘤細胞進行分析，利用各個細胞類型中微量的個體細胞找到了多個基因的不同表達，成功檢測出前列腺淋巴結癌細胞中的大多數活躍基因，并發現了不同的基因表達模式和生物標記物。

2．2胚胎和器官發育

來自斯坦福大學的研究團隊［17］從一名40歲男性體內分離出91個精子，并首次對它們進行單細胞測序。研究人員通過比較這名男性的精子基因組序列和他的二倍體細胞基因組序列，觀察到單倍體精子細胞染色體中哪些地方發生了重組。研究人員也在每個精子細胞中鑒定出25個～36個新的單核苷酸突變，這些突變在這名男性的二倍體細胞基因組中并不存在。這些隨機突變是產生遺傳變異的另一種方式，但是如果它們在基因組特定位點發生，那么它們能夠產生有害的影響。單細胞轉錄組測序技術在早期胚胎發育方面也有所應用。例如Yan等［31］從植入前胚胎和單個人類胚胎干細胞中選取了124個細胞，測定了它們的基因表達，并成功檢測到22 687個表達的基因，其中包括8 701個長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。2．3免疫系統

近年來，單細胞轉錄組測序技術開始被應用于免疫系統的研究當中。免疫細胞對抗原物質的應答反應具有復雜和不均一性的異質性特點，單細胞轉錄組測序技術有望在此方面揭示豐富的未知信息。最近Shalek等［32］就對脂多糖誘導的樹突狀細胞應答反應進行了研究。脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，能夠通過激活樹突狀細胞的Toll樣受體引發顯著的轉錄組改變。研究者利用RNA轉錄5′末端轉換機制技術對18個小鼠骨髓來源的樹突狀細胞進行了cDNA文庫的構建，并進行測序分析，他們發現在單細胞水平上，樹突狀細胞的反應具有高度的異質性［32］。許多已知的炎癥反應基因在部分細胞中被強烈激活，而在其他細胞中僅被低度激活或完全未被激活，并且進一步發現這種反應應答的異質性源于兩個方面，一方面是樹突狀細胞的成熟狀態，另一方面則是基因調控網絡的隨機性特征。

通過上述的實例，我們不難看出單細胞轉錄組測序技術在疾病研究等領域具有重大的應用價值。相信隨著其技術的不斷發展和完善，單細胞轉錄組測序技術可以揭示更多基因表達網絡、異質性、隨機性表達等相關信息，從而更加完善地揭示更多疾病的機理，為人類戰勝疾病奠定理論基礎。

3　展望

近年來，單細胞轉錄組測序技術已經取得了較為明顯的發展，被應用于諸多領域，從最初的哺乳動物早期胚胎發育階段的轉錄組分析，到組織器官的發育，再到免疫系統和腫瘤等研究領域都可以見到單細胞轉錄組測序的身影。它的廣泛應用為科研人員研究細胞之間的異質性帶來了希望，使人們對各種疾病的發病機理有了更為深刻和具體的認識。

為了使單細胞轉錄組測序技術能夠在未來發揮更大的作用，還應當將其與其他技術相結合，例如細胞成像技術等。另外，單細胞轉錄組測序技術應當朝著更加高通量的方向發展，在未來實現不單單針對單個樣品或細胞的大規模集成化的分析，從而大大節約時間和成本。最后，由于目前的單細胞轉錄組測序技術的操作過程相對比較繁瑣，過多的依賴實驗人員的操作技術，使得該技術的效率和穩定性都有所欠缺，為此應當朝著自動化的方向進一步發展，爭取實現整個過程的自動操作。

總之，相信隨著單細胞轉錄組測序技術的不斷發展，各技術環節的日臻完善，其必將在醫療衛生等領域取得更加豐碩的成果，成為人們治療疾病、探索生命科學的一項必不可少的技術。

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通訊作者：★浦春，E-mail：philpcpu＠163．com

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