APETX2對氯化鋰-匹魯卡品誘導癇性發(fā)作大鼠的影響及機制探究

陳康　康玉琪　王艷　梁靜靜　盧祖能　何小華　朱帆　肖哲曼

430060　武漢，武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)內科[陳康　康玉琪　王艷　梁靜靜　盧祖能　肖哲曼(通信作者)]；武漢大學基礎學院病原生物學系(朱帆)；武漢大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學系(何小華)

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APETX2對氯化鋰-匹魯卡品誘導癇性發(fā)作大鼠的影響及機制探究

陳康康玉琪王艷梁靜靜盧祖能何小華朱帆肖哲曼

430060武漢，武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)內科[陳康康玉琪王艷梁靜靜盧祖能肖哲曼(通信作者)]；武漢大學基礎學院病原生物學系(朱帆)；武漢大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學系(何小華)

【摘要】目的探索APETX2對氯化鋰-匹魯卡品誘導癇性發(fā)作大鼠的行為學影響及可能的機制。方法成年雄性SPF級SD大鼠18只，側腦室置管后隨機分為：癲癇組(9只)、APETx2組(9只)，癲癇造模后觀察2組癲癇大發(fā)作潛伏期及發(fā)作強度；APETx2處理原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，動態(tài)觀察其對鈣成像的影響。結果APETx2組的SD大鼠癲癇潛伏期延長，大發(fā)作程度減輕；APETx2處理原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元鈣內流下降。結論APETx2可抑制氯化鋰-匹魯卡品誘導SD大鼠癇性發(fā)作，減少酸誘導海馬神經(jīng)元鈣離子濃度增加可能為機制之一。

【關鍵詞】APETx2癲癇行為學鈣成像海馬

據(jù)WHO報道，世界上約有5000萬癲癇患者，30%的新確診癲癇兒童和成人患者使用抗癲癇藥物不能完全控制癲癇發(fā)作，30%的兒童患者和40%的成人患者需要長期服藥或者服藥依然不能控制而成為難治性癲癇[1]。癲癇發(fā)病機制的探討及治療手段的尋求，一直是神經(jīng)科學研究的熱點。自2001年Biagini G[2〗[2]。但目前關于ASICs的研究并不完全清楚，特別是ASIC3在癲癇中的研究較少，為明確ASIC3在癲癇發(fā)作中的作用，本研究通過ASIC3特異性阻斷海葵毒素APETx2，觀察其對氯化鋰-匹魯卡品誘導癲癇發(fā)作SD大鼠的行為學以及海馬神經(jīng)元功能的影響。

1材料與方法

1.1實驗對象200～230 g雄性SD大鼠18只；新生SD大鼠4只。

1.2主要試劑轉鐵蛋白(sigma)；Glutamax(sigma)；B-27(sigma)；牛胰島素(Amresco)；FBS(Gibico)胰蛋白酶；APETx2(smartox)。

1.3主要儀器設備離心機(六一)；大鼠腦立體定位儀(瑞沃德)。

1.4側腦室置管

在武漢大學實驗動物中心購買雄性SD大鼠200 g左右，給予充足食物和水分，保持適宜溫度、濕度和晝夜節(jié)律，使其適應環(huán)境4～7 d;置管當天選取200～230 g大鼠，10%水合氯醛，350 mg/kg腹腔注射，30 s～3 min倒地后即可開始側腦室置管手術。符合麻醉要求的SD大鼠置于手術臺上，取俯臥位，四肢張開;手術器械75%酒精浸泡消毒，去掉頭頂毛發(fā)，75%酒精消毒皮膚，前囟位置大概位于大鼠的雙眼與雙耳交叉連線處，以交點為中心正中剪開頭皮約1.5 cm，逐層分離直至暴露顱骨，可見矢狀縫和冠狀縫，兩者相交之處既是前囟點(Bregma);將大鼠固定于立體定位儀上，調整門齒桿位置，齒桿前上緣低于耳桿中心3.3 mm使前囟呈水平位，以前囟點(Bregma)為原點，測量前囟點(Bregma)與后囟點(lambda)距離，以0.9cm為標準，穿刺點的位置和深度據(jù)此標準按比例進行折算調整;選取穿刺點位置：Bregma點后(AP)0.8 mm, 矢狀縫右側(L)1.5 mm，標記后使用牙科手電鉆鉆孔，孔徑1 mm，勿傷及硬腦膜及腦組織，以免出血。將套管垂直插入腦中，此時無液體流出，502膠水固定底座于顱骨上，固化后在底座周圍均涂上適量502膠水，勿將膠水流向周圍組織，膠水固化后縫合皮膚，皮膚縫合處涂上一層紅霉素軟膏，以防傷口及顱內感染;大鼠單籠飼養(yǎng)，給予充足食物和水分，飼養(yǎng)5～7 d，渡過手術應激期即可癲癇造模。

1.5癲癇模型制備，大鼠行為學觀察

癲癇造模前1 d腹腔注射1.25%氯化鋰125 mg/kg，給予氯化鋰18～24 h內側腦室給予毒素，毒素和匹魯卡品溶劑均為PBS(Phosphate Buffered Saline，pH=7.4);側腦室給藥時將大鼠固定在大鼠固定器中，待其安靜后將內芯管插入套管中，可見清亮腦脊液從內芯管緩慢流出，說明內芯管進入側腦室，將內芯管接上微量注射器，緩慢給藥，3 min給完，停留3 min緩慢拔去內芯，1 min拔出;半小時后腹腔給予1%匹魯卡品35 mg/kg，觀察并記錄其行為學變化，主要包括豎毛、血淚、咀嚼、點頭、上肢抽搐、直立、倒地、強直;按發(fā)作程度按Racine分級給分：0分為0級，沒反應；1分為1級，少動；2分為2級，點頭；3分為3級，上肢抽動；4分為4級，直立；5分為5級，摔倒；6分為6級，強直-陣攣或死亡。給藥方式(表1)。按Racine分級標準，達到4級雙下肢直立即達到大鼠癲癇大發(fā)作，從給予腹腔注射匹魯卡品到SD大鼠癲癇發(fā)作達到4級這段時間，即是癲癇大發(fā)作潛伏期。潛伏期可反映癲癇的易感性或癲癇“閾值”：潛伏期越短，癲癇易感性越強，閾值越低。記錄各組潛伏期數(shù)值，由于側腦室給予APETx2后部分大鼠癲癇達不到4級，將還未大發(fā)作的時間記為我們的觀察時間120 min。從腹腔注射匹魯卡品計時120 min，大鼠在觀察期間達到的最高Racine得分為大鼠在觀察期間的癲癇發(fā)作最高等級，作為大鼠癲癇發(fā)作強度指標，反映癲癇發(fā)作的嚴重程度，得分越高，發(fā)作程度越重。

表1　癲癇造模給藥方式

1.6細胞培養(yǎng)及鈣離子成像

1.6.1培養(yǎng)板的預處理

培養(yǎng)前2 h將玻片用0.1 mg/mL多聚賴氨酸包被10 min，吸除，自然晾干，用PBS漂洗2次，置于培養(yǎng)箱中備用。

1.6.2海馬神經(jīng)元的分離、種植和培養(yǎng)

在武漢大學實驗動物中心購買新生SD大鼠(24 h內出生)，使用75%酒精消毒后斷頭，將頭轉移至超凈臺內75%酒精中浸泡2～3 s，將頭迅速轉移至預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中漂洗，剪開頭皮，暴露未骨化顱骨，剝離顱骨，將整個腦部分離出顱后轉移至另一個預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，使用彎頭眼科鑷從扣帶回處進入側腦室，向后分離掀開海馬上方皮層，暴露海馬，海馬呈白色新月形，離斷海馬足端，同樣方法暴露對側海馬，可見兩側海馬在穹窿連合處聯(lián)系，夾起穹窿連合即可將兩側海馬一同取出,以上操作均在冰上進行;取海馬加入1.5 mLEP管中，顯微剪剪碎，轉移至0.125%胰蛋白酶的4 mL離心管中，37 ℃水浴消化，10 min后加10%血清的培養(yǎng)基停止消化，將組織吹打散開，100 g離心沉淀細胞，去上清，加種植液后吹打重懸，將細胞均勻種植在24孔板中 包被的蓋玻片上，每孔加60 uL懸液，細胞密度在105～106/cm2以內，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中貼壁，6 h后補加種植液200 uL，24 h后使用維持液1/2換液，以后每3 d 1/2換液;種植液：50 mL MEM、10 mg NaHCO3、 5 mg轉鐵蛋白、0.5 mL Glutamax、1.25 mg胰島素、5 mL FBS；維持液：100 mL MEM、20 mg NaHCO3、10 mg轉鐵蛋白、0.25 mL Glutamax、2 mL B27、5 mL FBS。培養(yǎng)至6～8天時處理。

1.6.3海馬神經(jīng)元鈣成像

細胞外液配制(mM)：NaCl 150，KCl 5，MgCl2·6H2O 1，CaCl22，Glucose 10，HEPES 10，用Tris-OH將pH調至6.0、7.4;標準腦脊液配制(mM)：NaCl 150，KCl 5，MgCl2·6H2O 1，CaCl22，Glucose 10，HEPES 10，用Tris-OH將pH調至7.4。細胞培養(yǎng)至6～8天，吸出24孔板中培養(yǎng)基，用標準腦脊液清洗3次，然后用4 uM flou8(AAT Bioquest)標準腦脊液37 ℃孵育30 min進行鈣染料負載;標準腦脊液清洗3次，洗去多余鈣染料，最后用標準腦脊液37 ℃穩(wěn)定孵育30 min，取出玻片固定在共聚焦皿中，共聚焦皿中加入200 uL pH 7.4細胞外液，將共聚焦皿放在活細胞工作站的移動平臺上的卡槽中，在倒置熒光顯微鏡下選好細胞區(qū)域，在494 nn激發(fā)波長下517 nn的發(fā)射波長處的熒光強度可實時反映細胞內鈣離子濃度的變化;采用細胞旁給藥法，使細胞外液pH在7.4和6.0間切換;細胞內鈣離子熒光凈升高值(△F)為鈣離子熒光峰值減去靜息期鈣離子熒光值(F)，△F/F即可反映胞內鈣離子水平的變化。培養(yǎng)至6～8 d原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元進行鈣成像，當細胞外液pH調整為6.0時，觀察到不同濃度APETx2細胞內鈣離子水平變化，圖3所示。

1.7統(tǒng)計學處理

2結果

2.1APETX2對SD大鼠癇性發(fā)作潛伏期的影響

2組潛伏期分別為癲癇組(n=9)：(22.65±1.613)min；APETX2組(n=9)：(67.73±13.19)min。2組均符合正態(tài)分布(單樣本k-s檢驗P=0.144)，但方差不齊(F=66.87，DFn=8，Dfd=8，P<0.000 1)，故使用校正t檢驗比較2組潛伏期：2組潛伏期差異顯著(P=0.009 5)(圖1)，即APETx2可延長癲癇大發(fā)作潛伏期，降低癲癇的易感性，提高癲癇閾值。

圖1 2組癲癇大發(fā)作潛伏期癲癇組潛伏期(n=9)為(22.65±1.613)min;APETX2組潛伏期(n=9)為(67.73±13.19)min;校正t檢驗:P值=0.0095,兩組間比較具有統(tǒng)計學差異

2.2APETX2對SD大鼠癇性發(fā)作強度的影響

2組Racine得分均值分別為癲癇組Racine分級得分(n=9)為(5.333±0.235 7)分；APETx2組(n=9)為(3.556±0.337 9)分；符合正態(tài)分布和方差齊性，2組間癲癇發(fā)作嚴重程度具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖2 2組Racine分級得分均值比較,癲癇組Racine分級得分(n=9)為(5.333±0.2357)分;APETx2組Racine分級得分(n=9)為(3.556±0.3379)分;與癲癇組比較,*P<0.05

2.3APETX2對海馬神經(jīng)元胞內鈣離子水平的影響

經(jīng)過計算得到胞內鈣離子濃度ΔF/F：對照組為0.525 4±0.079 73，APETx2 0.1 uM組為0.378 2±0.103 9，APETx2 0.2 uM組為0.343 1±0.041 12，APETx2 1 uM組為0.154 0±0.033 31，APETx2 2 uM組為0。單因素方差分析(P<0.001)，2組間t檢驗：海馬組vs APETx2 0.2 uM組(P>0.05)；海馬組vs APETx2 1 uM組(P=0.012 4)；海馬組vs APETx2 2 uM組(P<0.01)(圖3～4)。

圖3 原代海馬神經(jīng)元鈣成像,胞內鈣離子水平的變化A為對照組;B為APETx20.1uM組;C為APETx20.2uM組;D為APETx21uM組;E為APETx22uM組

圖4 原代海馬神經(jīng)元鈣成像,APETx2對酸誘導胞內鈣離子水平ΔF/F影響對照組ΔF/F為0.5254±0.07973;APETx20.1uM組為0.3782±0.1039;APETx20.2uM組為0.3431±0.04112;APETx21uM組為0.1540±0.03331;APETx22uM組為0。單因素方差分析(P<0.001)。與海馬組比較,ΔP>0.05;*P<0.01

3討論

癲癇是最常見的慢性腦部疾病之一[3]。癲癇占全球疾病負擔的0.75%，WHO已將癲癇作為重大的公共衛(wèi)生問題[1]。其中顳葉癲癇(TLE)是一種較為常見的局灶性癲癇，70%~80%的患者可發(fā)展成為難治性癲癇[4]。顳葉癲癇的病理變化主要有海馬硬化及其他病理改變如腫瘤、血管畸形，外傷瘢痕、皮質異位癥、發(fā)育不良及其他非特異性改變[5]。由于海馬的解剖結構和血供的特殊性，其神經(jīng)興奮閾值較低，缺血缺氧耐受性差，80%的TLE致癇灶位于顳葉海馬,故顳葉癲癇又稱為海馬癲癇。癲癇的發(fā)病機制非常復雜，癇性放電的起始、傳播及終止的任一環(huán)節(jié)均可影響癲癇的發(fā)生。氯化鋰-匹羅卡品模型與人類顳葉癲癇TLE有著相似的發(fā)病形式和分子病理學改變，可用來模擬人類顳葉癲癇TLE模型[6]。

神經(jīng)元的強烈興奮和癲癇活動時腦內pH值顯著降低時ASICs的激活可能在癲癇的發(fā)生維持中有著重要作用[7-10]。酸敏感離子通道(ASICs)是氫離子(質子)配體門控鈉通道，屬于ENaC(Epithelial sodium channels)/DEG(Degenerins)通道家族，目前研究已發(fā)現(xiàn)其4個基因編碼的6種亞型，分別是：ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和 ASIC4。ASIC3是所有ASICs家族中對細胞外pH變化最敏感的，其中位pH僅為6.7[]11。ASIC3還是其家族中唯一一個能產(chǎn)生持續(xù)性穩(wěn)態(tài)電流的離子通道[12]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種ASIC3異聚體[13-14]ASIC1a/ASIC3、ASIC1b/ASIC3、ASIC2a/ASIC3和ASIC3/ASIC2b。ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3在海馬中均發(fā)現(xiàn)有表達，ASIC1b/ASIC3認為主要在外周神經(jīng)系統(tǒng)參與疼痛調節(jié)。Du等[15]在垂體中發(fā)現(xiàn)ASIC1b表達，Cao等[16]發(fā)現(xiàn)ASIC1b腦干中表達，目前ASIC1b在海馬中的表達還未得到證實。ASIC2b作為亞基構成 ASICs異聚體，能夠改變離子通道的特性，形成特異性的電流[]17。阿米洛利是ASICs非特異性的阻斷，可直接阻斷ASICs；PcTX1是ASIC1a特異性的抑制劑，通過門控的調節(jié)離子通道對H+的親和性來改變其失活狀態(tài)[18]。APETx2 能夠可逆性的抑制大鼠ASIC3電流，其中ASIC3/ASIC3中位濃度為63 nM；ASIC2b/ASIC3的中位濃度為117 nM；ASIC1b/ASIC3的中位濃度為0.9 μM；ASIC1a/ASIC3的中位濃度為2 μM；APETx2對ASIC2a-ASIC3無效[19]。

關于癲癇與ASICs的研究目前并不多，梁靜靜[20]、陳熙明[21]動物實驗發(fā)現(xiàn)，激活ASIC1a、ASIC3通道可以加重大鼠癲癇發(fā)作，而抑制ASIC1a、ASIC3通道可以抑制大鼠癲癇發(fā)作。提示ASIC1a或ASIC3可能與癲癇發(fā)作起始有關。Biagini G等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)的癲癇持續(xù)狀態(tài)動物模型中，ASIC1a 的mRNA在CA1-2區(qū)表達降低。Xiong ZG等[22]動物實驗中通過腦電圖發(fā)現(xiàn)，側腦室注射 PcTX1能夠減少紅藻氨酸癲癇模型鼠的癲癇活動，在紅藻氨酸和戊四氮癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作程度和易感性均下降；在海馬腦片上，持續(xù)灌注阿米洛利或者PcTX1能夠降低高頻電刺激或者無Mg+液體誘發(fā)的癲癇樣活動的幅度和頻率。Ziemann AE等[23]通過腦電圖、腦片研究發(fā)現(xiàn)敲除 ASIC1a基因小鼠癲癇發(fā)作強度增加，癲癇持續(xù)狀態(tài)時間延長，但大發(fā)作潛伏期不改變；激活ASIC1a時癲癇發(fā)作強度降低，癲癇持續(xù)狀態(tài)時間縮短，大發(fā)作潛伏期依然不變。Lin SH等[24]對2000-2014年間ASICs基因敲除進行系統(tǒng)的回顧性研究，ASIC1有3種敲除模型，ASIC3有6種敲除模型，但與癲癇研究相關的只有Ziemann AE的ASIC1a敲除模型。2015年Lin SH等[25]ASIC4敲除模型未發(fā)現(xiàn)其對癲癇的影響；作為ASIC4敲除的對照，其進行ASIC1a敲除實驗也證實ASIC1a可終止癲癇發(fā)作。針對PCTx1與ASIC1a knockout對癲癇發(fā)作影響差異，我們推斷，PCTx1不能像敲除ASIC1a那樣，可以抑制所有ASIC1a的同聚體或異聚體，Chen等[26]發(fā)現(xiàn)PcTx1還可激活ASIC1b；同時，ASIC3在其中也發(fā)揮了重要作用，因為兩者均未考慮ASIC3在癲癇中的作用。故我們通過ASIC3特異性阻斷劑探索ASIC3在癲癇中的作用，發(fā)現(xiàn)APETx2可抑制氯化鋰-匹魯卡品誘導的癲發(fā)作，不論是發(fā)作潛伏期，還是發(fā)作強度都有明顯抑制效果；同時，我們對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進行鈣成像實驗，鈣成像可以反映一群神經(jīng)細胞電生理活性，也可看到單個細胞在這群細胞中的行為學變化，有點有面，這一點腦片和單細胞膜片鉗是無法比擬的。通過鈣成像我們發(fā)現(xiàn)APETx2濃度較低時抑制海馬神經(jīng)元鈣內流作用較差，其抑制作用隨濃度增加而加強，對ASIC3的同聚體或異聚體抑制程度加大、種類增多，故我們認為大劑量APETx2可減少酸誘導的鈣內流，降低海馬區(qū)神經(jīng)興奮性，而這種作用可能是ASIC3的同聚體或異聚體所介導的。APETx2通過抑制海馬神經(jīng)元ASIC3同聚體或異聚體介導的離子內流，一方面可以提升膜內外電位差，從而降低海馬區(qū)神經(jīng)細胞興奮性；另一方面減少鈣作為信使介導一系列病理生理反應，穩(wěn)定細胞狀態(tài)，最終，穩(wěn)定海馬區(qū)細胞的癇性放電，達到抗癲癇效果。Cao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，APETx2使急性大鼠癲癇模型的潛伏期縮短，發(fā)作強度增加，這與我們的研究結果不同，Cao等的模型和給藥與我們有兩處重要的差異，其匹魯卡品劑量為50 mg/kg，我們實驗中發(fā)現(xiàn)，30 mg/kg即可引發(fā)大鼠癲癇Racine 4級以上發(fā)作，我們使用劑量為35 mg/kg；我們側腦室APETx2的劑量要比Cao高，兩者綜合的效果，我們不僅抑制了抑制性的中間神經(jīng)元ASIC3，我們還可能抑制海馬區(qū)大部分興奮性的神經(jīng)細胞群上的ASIC3。故我們猜想，在ASIC3敲除的動物模型的癲癇易感性會下降，發(fā)作潛伏期延長和發(fā)作強度下降，需要進行證實以驗證我們的猜想。有趣的是，Cao等發(fā)現(xiàn)的顳葉癲癇患者中ASIC3無論是mRNA還是蛋白表達均增加，大鼠慢性癲癇模型中ASIC3表達也增加，也進一步驗證ASIC3是參與癲癇的啟動或維持的。

綜上所述，APETx2可抑制氯化鋰-匹魯卡品誘導SD大鼠癇性發(fā)作，減少酸誘導海馬神經(jīng)元鈣離子濃度增加，提升海馬區(qū)癲癇“閾值”，抑制癲癇的起始及維持。ASIC3或者ASIC3的異聚體可能參與了癲癇的啟動或維持。

本研究不足之處，癲癇發(fā)作程度依靠行為學評定，簡單直觀，能配合的腦電圖更有說服力；APETx2對ASIC3同聚體和異聚體都有阻斷作用，ASIC1a-ASIC3、ASIC2a-ASIC3和ASIC3-ASIC2b、ASIC3-ASIC3在癲癇中誰起主導作用未能明確。故后續(xù)研究中可通過電生理手段、基因打靶等技術的應用進行完善以探究癲癇機制，為抗癲癇治療提供準確靶點。

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【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.01.008

Effects of APETX2 on ethology of rat seizures induced by lithium chloride - pilocarpine induced and its mechanism explorationChenKang,KangYuqi,WangYan,etal.DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of APETX2 on ethology of lithium chloride-pilocarpine induced seizures rat and possible mechanism. MethodsAdult male Specific pathogen Free Sprague Dawley rats (n=18) were randomly divided into two groups after lateral ventricle intubating: APETX2 group (n=9) and control group (n=9). The latencies and severity of epileptic seizure were compared between two groups after building epileptic model. The effects of APETX2 on calcium imaging about primary hippocampal neurons were dynamically observed. ResultsAPETX2 obviously prolonged the latencies of epileptic seizure and reduced seizure degree. Primary hippocampal neurons' calcium imaging inflowing decreased significantly in APETX2 group. ConclusionAPETX2 can inhibit lithium chloride-pilocarpine induced rat seizures. One of its mechanisms may be that APETX2 reduced calcium ion concentration enhancement induced by acid in hippocampal neurons.

【Key words】APETX2EpilepsyEthologyCalcium imagingHippocampus

【中圖分類號】R742.1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)01-0030-06

基金項目：國家自然科學基金(81471133)；湖北省自然科學基金(2014CFB734)

(2015-06-30收稿2015-07-27修回)