Survivin、VEGF、EGFR在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

汪 巧，胡向陽，張曉亮，丁 婧

Survivin、VEGF、EGFR在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

汪 巧1，2，胡向陽1，2，張曉亮3，丁 婧4

目的探討存活素（Survivin）、血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子受體（EGFR）蛋白在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的意義。方法采用免疫組化Envision法檢測100例PTC以及癌旁正常甲狀腺組織中的Survivin、VEGF、EGFR蛋白表達狀況。結果①Survivin、VEGF和EGFR在PTC中的陽性表達率分別為58%、75%、84%，顯著高于癌旁正常甲狀腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；②Survivin和VEGF在伴有淋巴結轉移的乳頭狀癌組織陽性表達率分別為73.3%、90%，顯著高于無轉移組，與其它臨床病理參數無相關性；③EGFR在女性患者組織表達率為90.2%，顯著高于男性患者55.6%，差異有統計學意義（P＜0.05）；④Survivin與EGFR在PTC中表達存在正相關性（χ2=5.595，P＜0.05，r=0.237）。結論Survivin、VEGF和EGFR可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發生發展過程，其中Survivin和VEGF可能與腫瘤淋巴結轉移有關；Survivin和EGFR可能存在協同作用。VEGF、EGFR在PTC組織中高表達，為將針對VEGF、EGFR靶點的靶向藥物用于甲狀腺乳頭狀癌治療的構想提供了初步的實驗依據。

甲狀腺乳頭狀癌；Survivin；VEGF；EGFR

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，其發病率現在以4%的增幅逐年攀升，成為近20年發病率增長最快的實體惡性腫瘤［1］。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的一種組織學類型，約占70%～85%。臨床對于PTC的治療主要依靠手術，而放療、化療基本無效，尤其是對于晚期難治的PTC患者［2］。分子靶向藥物治療成為近年來的一大熱點，它具有特異性強、療效可靠、損傷較小等優點，給甲狀腺癌的治療帶來巨大的潛力和廣闊的前景。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是蛋白酪氨酸激酶抑制劑作用的主要靶點，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）則是腫瘤新生血管有關的靶點，目前針對二者的靶向藥物已在多種惡性腫瘤的治療中取得了一定的療效。調查顯示國外針對VEGFR2靶點的4種靶向藥物（索拉非尼、樂伐替尼、凡德尼布和卡博替尼），已獲得FDA批準用于晚期甲狀腺髓樣癌和難治性分化性甲狀腺癌的治療，治療結果顯示明顯延長患者中位無進展生存期［3］，而國內相關研究仍然較少。存活素（Survivin）參與了腫瘤組織血管的形成，其表達的組織差異性特點使其成為惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。該研究旨在通過觀察Survivin、VEGF、EGFR三種蛋白在PTC中的表達，進而探討三者同時在調控PTC生長、轉移方面的相關意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集安徽醫科大學第一附屬醫院病理科存檔的2010年1月～2013年6月的PTC手術標本病例100例（其中30例有明確的淋巴結轉移）組織和100例癌旁正常甲狀腺組織。

1.1.2試劑 即用型Survivin鼠抗人單克隆抗體（克隆號EP119）、即用型VEGF鼠抗人單克隆抗體（克隆號SPM225）、即用型EGFR兔抗人單克隆抗體（克隆號EP22）、EDTA修復液（pH 8.0）、PV-6000二步法免疫組化試劑盒和濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法免疫組化Envision兩步法檢測Survivin、VEGF、EGFR蛋白表達，按試劑盒說明書操作，使用已知陽性切片Survivin、VEGF、EGFR作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.1Survivin在PTC中的判讀標準 Survivin結果判讀標準（按每張切片計）：以細胞核出現棕黃色著色為陽性細胞，陽性細胞數≥10%為陽性，否則為陰性。

1.2.2VEGF、EGFR在PTC中的判讀標準VEGF、EGFR結果判讀標準（按每張切片計）：VEGF陽性定位于細胞質，部分可伴有細胞核著色；EGFR陽性定位于細胞膜，均為棕黃色顆粒。按染色陽性細胞數計分（5級）：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度計分（4級）：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩積分數相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（2+），9～12為（3+）。

1.3 統計學處理使用SPSS19.0軟件進行分析。采用χ2檢驗及Fisher精確概率法，相關性分析采用Pearsonχ2檢驗及列聯系數。

2 結果

2.1 PTC與癌旁正常甲狀腺組織Survivin、VEGF、EGFR蛋白表達狀況

2.1.1Survivin蛋白的表達 Survivin在PTC中著色部位在細胞核，部分伴有細胞質著色，其在100例PTC中陽性表達率為58%，而在癌旁正常甲狀腺組織未見表達（圖1A、1B）。Survivin在PTC和癌旁正常甲狀腺組織中的表達差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.1.2VEGF蛋白的表達 VEGF在PTC中著色部位在細胞質，部分伴有細胞核著色，其在PTC中的陽性率為75%（圖1C），在癌旁正常甲狀腺組織中VEGF蛋白未見表達。VEGF在PTC與癌旁正常甲狀腺組織間表達差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

2.1.3EGFR蛋白的表達 EGFR在PTC中著色部位在細胞膜，部分伴有胞質著色，其在PTC中的陽性率為84%，在癌旁正常甲狀腺組織中EGFR蛋白未見表達（圖1D）。EGFR在PTC與癌旁正常甲狀腺組織間表達差異有統計學意義（P＜0.01），各標記在PTC與癌旁正常甲狀腺組織間表達情況的比較：Survivin組：χ2=81.7，P＜0.01；VEGF組：χ2=120，P＜0.01；EGFR組：χ2=144，P＜0.01，見表1。

2.2 PTC中Survivin、VEGF、EGFR蛋白的表達與臨床病理參數間的關系Survivin和VEGF在伴有淋巴結轉移組的表達率高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05），與患者年齡、性別和腫瘤大小無相關性；EGFR在女性患者腫瘤組織中表達高于男性患者，差異有統計學意義（P＜0.05），與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移均無相關性。見表2。

2.3 PTC中Survivin、VEGF、EGFR蛋白表達的相關性Survivin、VEGF、EGFR三種蛋白在PTC組織中表達的相關性（表3）。PTC中VEGF與Survivin、EGFR的蛋白表達無相關性；Survivin與EGFR的蛋白表達存在關聯（χ2=5.595，P＜0.05，r= 0.237）。

3 討論

Survivin是迄今發現最強的一種凋亡抑制因子，其作用遠遠大于B細胞淋巴瘤/白血病-2即bcl-2家族的作用。其主要通過兩種途徑抑制細胞凋亡：①與細胞周期蛋白激酶p34dc2及p34edk4發生作用，阻斷凋亡通路信號的轉導［4］；②直接通過抑制凋亡終末效應器Capase3和Capase7的活性，阻斷各種細胞凋亡過程［5］。此外，VEGF可上調血管內皮細胞中Survivin的表達，上調后的survivin以多種方式接受來自VEGF的信號，抑制血管內皮細胞的凋亡，借以維持VEGF誘導腫瘤血管生成的過程。大量研究［6］表明，Survivin在多種惡性腫瘤中表達，如乳腺癌、喉鱗狀細胞癌等，并且與腫瘤的惡性程度和預后有重要關系。分子生物學的研究［7］下調癌細胞株Survivin不僅加速細胞凋亡，同時能增強其對化療藥物的敏感性。本實驗結果顯示Survivin在PTC的陽性表達率為58%，顯著高于癌旁正常甲狀腺組織，提示Survivin可能參與PTC的發生發展過程，且Survivin表達還與淋巴結轉移有關，即發生淋巴結轉移的病例表達率明顯高于未發生淋巴結轉移的病例（P＜0.05），提示Survivin的高表達可能還與腫瘤的轉移及患者的預后密切相關。在本實驗中Survivin陽性主要定位于細胞核，部分伴有胞質著色，通常情況下，Survivin表達于癌細胞的胞質中，但對生長增殖旺盛的細胞也會在細胞核中表達［8-9］，研究［10］表明細胞質中表達的Survivin主要是通過促進腫瘤細胞的凋亡達到細胞保護功能，而細胞核中表達的Survivin蛋白主要是通過控制細胞分裂發揮作用，Survivin定位于細胞核常提示著腫瘤預后較差。

VEGF是重要的促血管生成因子，也是最強力的血管生成誘發劑，能通過旁分泌功能刺激血管內皮細胞增殖和遷移，促進腫瘤新生血管生成［11］。研究［12］表明，VEGF在多種人類腫瘤組織，包括甲狀腺癌中存在高表達。目前，在對VEGF以及相關的抑癌基因、基質酶類的相互作用深入研究的前提下，認為VEGF與甲狀腺腫瘤的生長和轉移密切相關，在其發生、發展和浸潤等生物學行為中發揮重要作用，且VEGF表達水平越高，惡性程度也越高［13］。本實驗中，VEGF在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達率為75%，顯著高于癌旁正常甲狀腺組織。表明VEGF對甲狀腺乳頭狀癌診斷有較好的提示意義。VEGF在乳頭狀癌有淋巴結轉移組中的陽性表達率為90.0%，高于無淋巴結轉移組的68.6%（P＜0.05），說明PTC發生、發展及淋巴結轉移與VEGF有關。

EGFR是原癌基因C-erB-1的表達產物，在正常生理情況下作為一類具有酪氨酸激酶活性的膜受體，是細胞表面的傳感器，EGFR與其配體結合后，成為細胞生長信號的發放者，調控細胞的增殖、黏附、轉移和分化過程。目前，在甲狀腺癌未分化癌、濾泡癌和髓樣癌中檢測到EGFR的高表達，但并未檢測到相一致的EGFR基因突變。在本實驗中使用的為EGFR擴增型蛋白抗體，實驗結果顯示EGFR在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達率為84%，顯著高于癌旁正常甲狀腺組織，提示EGFR在PTC的發生發展過程中發揮重要作用。此外本實驗中，EGFR在女性PTC患者的表達水平明顯高于男性患者，女性PTC患者雌激素水平較高，推測可能是EGFR與雌激素相互作用的結果。

綜合實驗結果推測：VEGF、EGFR蛋白在PTC組織高表達，為臨床上將相應靶向藥物應用于PTC治療的構想提供了初步的實驗依據，隨之可能帶來的臨床治療價值值得進一步深入討論。腫瘤是一種多因素并受多種信號影響的疾病，癌細胞容易對高選擇性抑制劑產生耐藥性，因而能阻斷多個細胞生長的信號轉導通路的多靶點激酶抑制劑在臨床上往往能取得更好的治療效果，這成為腫瘤治療和靶向藥物研發的新趨勢。分析Survivin、VEGF、EGFR三者在PTC表達的相關性，結果顯示Survivin和EGFR呈正相關性，提示在甲狀腺乳頭狀癌的增殖、浸潤和轉移過程中Survivin和EGFR可能存在協同作用，但目前對于二者具體相互作用機制尚未闡明。Wang et al［14］抑制EGFR高表達細胞株PI3激酶通路，檢測到Survivin蛋白水平明顯降低，而抑制MAP激酶途徑不影響Survivin蛋白水平，證實EGFR激活后影響PI3激酶通路從而影響Survivin蛋白的表達。研究中未顯示在PTC中VEGF與Survivin、EGFR存在相關性，與部分文獻提到的研究結果不完全相符，這可能與本實驗的標本量過小，實驗方法有一定差異有關。由于蛋白的表達和本身構象的高度不穩定性，需要進一步從DNA水平對PTC中Survivin、EGFR、VEGF的表達進行研究，從而達到“標本兼治。

［1］ 羅盛蘭，俞 敏，龔巍巍，等.甲狀腺癌的流行現狀及其危險因素［J］.中國預防醫學雜志，2013，14（4）：317-20.

［2］ 張曉亮，胡向陽，楊 懿，等.HER-2、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（7）：958 -61.

［3］ 楊中元，王 羲，李 茵，等.甲狀腺癌靶向治療進展［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2015，22（7）：803-10.

［4］ Suzuki A，Hayashida M，Ito T，et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16（INK4a）and Cdk2/cyclin E complex activation［J］.Oncogene，2000，19（29）：3225-34.

［5］ Shin S，Sung B J，Cho Y S，et al，An anti-apoptosis protein human surviving is a direct inhibitor of capase3 and 7［J］.Biochemistry，2001，40（4）：1117-23.

［6］ Gorgun D，Secik F，Midili K，et al.Diagnostic and prognostic significance of surviving levels in malignant pleural effusion［J］. Resoir Med，2013，107（8）：1260-5.

［7］ 韓 芳，黎 莉.靶向Survivin反義寡核苷酸對MCF-7乳腺癌細胞系Survivin mRNA及紫杉醇藥物敏感性的影響［J］.山東大學學報，2008，46（1）：36-9.

［8］ Kim Y A，Chang M，Park Y J，et al.Detection of surviving and COX-2 in thyroid carcinoma：anaplastic carcinoma shows overexpression of nuclear surviving and low COX-2 expression［J］.Korean JPathol，2012，46（1）：55-60.

［9］ Necochea-Campion R D，Chen C S，Mirshahidi S，etal，Clinicalpathologic relevance of Survivin spice variant expression in cancer［J］.Cancer Lett，2013，339（2）：167-74.

［10］ngels K，Knauer S，Metzler D，et al，Dynamic intracellular Survivin in oral squamous cell carcinoma：underlyingmolecularmechanism and potential as an early prognostic marker［J］.Pathol，2007，211（5）：532-40.

［11］吳偉群，何小杰，李延輝，等.VEGF在甲狀腺腫瘤中的表達及與腫瘤血管生成的關系［J］.中國醫藥科學，2013，3（12）：23-5.

［12］Zheng SQ，Huang PQ，Zhang Y J，et al，Role ofmatrixmetalloproteinase（MMP）-2 and-9 and vascular endothelial growth factor C in lymph nodemetastasis of breast cancer［J］.中華病理學雜志，2010，39（4）：240-4.

［13］Zhou Z H，Cui X N，Xing H G，et al.Changes and prognostic value of serum vascular endothelial growth factor in patients with differentiated thyroid cancer［J］.Med Prince Pract，2013，22（1）：24-8.

［14］Wang Q，Mark I，Greene.EFGR enhances Survivin expression through the phosphoinositide 3（PI-3）kinase signaling pathway［J］.Experimental and Molecular Pathology，2005，79，（2）：100 -7.

Expression and significance of Survivin，VEGF and EGFR in papillary thyroid carcinoma

Wang Qiao1，2，Hu Xiangyang1，2，Zhang Xiaoliang3，et al
（1Dept of Pathology，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；3Dep of Pathology，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001）

ObjectiveTo explore the significance of Survivin protein，EGFR protein and VEGF protein in papillarythyroid carcinoma（PTC）.MethodsImmunohistochemical staining was performed in 100 specimens of PTC and 100 specimens of adjacent normal thyroid tissue to examine the expression of Survivin protein，VEGF protein and EGFR protein.Results①The positive ratios of Survivin，EGFR and VEGF in PTC were 58%，75%and 84%，which were significantly higher than the expression levels of adjacent normal thyroid tissue.Therewas all statistical difference between them（P＜0.05）.②The positive ratios of Survivin and VEGF in PTC with lymph nodemetastasiswere 73.3%and 90%，which were prominently higher than those without lymph nodemetastasis.No relationships were found between expression of the makers and other clinicopathological features in PTC.③The positive expression rates of EGFR in female patients was 90.2%，dramaticlly higher than that ofmale patients 55.6%. There was statistical difference between them（P＜0.05）.④The expressions of Survivin and VEGF were positively correlated in PTC（χ2=5.595，P＜0.05，r=0.237）.ConclusionThe Survivin，VEGF and EGFR may be involved in the occurrence and development process of PTC，Moreover，Survivin and VEGFmay promote the procedure of cancer cell spreading to lymph nodes；theremay exist synergistic effectbetween Survivin and EGFR.The over expression of Survivin，VEGF and EGFR in PTCmay provide preliminary experimental basis for the treatmentof PTC，which using corresfncollege targeted drugs.

papillary thyroid carcinoma；Survivin；VEGF；EGFR

R 736.1

A

1000-1492（2016）03-0442-05

時間：2016/1/28 14：23：11 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.060.html

2016-01-18接收

國家臨床重點專科建設項目經費資助（編號：3101005004021）

1安徽醫科大學病理學教研室，合肥 230032

2安徽醫科大學第一附屬醫院病理科，合肥 230022

3安徽省立醫院病理科，合肥 230001

4安徽省胸科醫院，合肥 230020

汪 巧，女，碩士研究生；

胡向陽，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：yfhxy2013@163.com