基于細胞代謝組學技術的關黃柏潛在有效成分木蘭堿對前列腺癌細胞的治療作用研究＊

張天雷，邱 時，李先娜，張愛華，孫 暉

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

基于細胞代謝組學技術的關黃柏潛在有效成分木蘭堿對前列腺癌細胞的治療作用研究＊

張天雷，邱 時，李先娜，張愛華，孫 暉＊＊

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本文在木蘭堿藥效學研究基礎之上，進行基于UPLC-HDMS/MS技術的細胞代謝組學研究，探討木蘭堿抗前列腺癌的潛在作用機制。方法：將對數期22RV1前列腺癌細胞以適宜密度接種并分為空白組及木蘭堿給藥組，以細胞形態學觀察、MTT比色法以及流式細胞術分析前列腺癌細胞系22RV1在給藥前后的細胞形態變化、細胞存活和增殖狀況以及藥物誘導凋亡的作用和作用強度，從藥效學角度評價木蘭堿的體外抗前列腺癌活性。進一步提取前列腺癌細胞內液并利用高通量液質聯用技術平臺對細胞代謝軌跡進行研究，揭示木蘭堿給藥前后內源性差異代謝物變化情況。結果：研究發現木蘭堿能通過誘導22RV1前列腺癌細胞凋亡而抑制其增殖，給藥后細胞生長狀況明顯變差，顯微鏡下難以見到分裂細胞，培養基中散在大量細胞碎片。本研究共鑒定了肌醇、鞘磷脂等13個藥效生物標志物；代謝經路研究顯示包括淀粉和蔗糖代謝、核黃素代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等7條能量代謝及氨基酸代謝途徑發生明顯擾動。結論：木蘭堿對22RV1前列腺癌細胞系有明顯體外增殖抑制作用，潛在機制為對多種能量及氨基酸等代謝途徑的干預作用。本研究闡明木蘭堿治療前列腺癌的整體效應機制，可為發現臨床有效且毒副作用小的抗前列腺癌藥物提供一定依據。

木蘭堿 前列腺癌 代謝組學 生物標志物

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）是一種臨床常見的男性惡性腫瘤，發病隱匿、早期診斷較為困難，至癥狀出現并采取治療措施時往往已錯過最佳時機，還易發生淋巴轉移及骨轉移[1]，在歐美國家發病率居男性惡性腫瘤之首，死亡率則僅次于肺癌。近年來中國前列腺癌發病率也呈快速上升趨勢，嚴重威脅男性健康。傳統的治療手法包括激素治療及手術摘除，晚期前列腺癌以放、化療和免疫療法為主。但晚期前列腺癌病程后期往往轉化為激素抵抗型前列腺癌，內分泌療法難以奏效[2-4]。同時傳統化療藥物有很大毒副作用以及多耐藥問題。因此從天然藥物中尋找高效低毒的抗癌活性成分，成為新藥研發的重要途徑。關黃柏為常用傳統中藥，被《神農本草經》列為上品，是蕓香科黃柏屬植物黃檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥樹皮。多種針對關黃柏的研究證實其具有抗菌消炎、抗癌、前列腺滲透、改善免疫力以及降壓等功效。近年來對黃柏所含的多種化學活性成分展開了深入研究，關黃柏主要活性成分是生物堿類，被認為是其藥效的主要部分，如：小檗堿、木蘭堿等。本課題組前期研究表明木蘭堿是關黃柏主要入血成分之一。本研究以關黃柏潛在有效成分木蘭堿為研究對象，進行前列腺癌細胞系22RV1體外增殖抑制的代謝組學研究，在藥效評價的基礎之上確定木蘭堿抗前列腺癌的藥效生物標志物并進行代謝通路的分析。

1 材料與方法

1.1 細胞系

本研究采用22RV1前列腺癌細胞系，該細胞系是常見的惡性前列腺癌細胞系，也是研究高侵襲性激素抵抗型前列腺癌的理想細胞系[5]。該細胞系經由南京科佰生物科技有限公司進口自美國ATCC細胞庫。

1.2 藥品與試劑

木蘭堿標準品購自中國藥品生物制品檢定所。胎牛血清（美國Gibico公司，批號：10099-141）；胰蛋白酶（美國Hyclone公司，批號：SH30042.01B）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國Sigma公司，批號：M2128-100MG）；RPMI-1640細胞培養液（美國Hyclone公司，批號：SH30027.01 1X）；Viacount細胞計數試劑、細胞凋亡檢測試劑盒（美國Millipore公司，批號：PF032-1EACN）。亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇（色譜級，德國Merck技術有限公司）；甲酸（色譜級，天津科密歐化學試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）。

1.3 儀器與耗材

生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司，型號：BSC-1100-LIIA2）；數顯加熱鍋（德國IKA公司，型號：HB10 digital）；流式細胞儀（美國Merck-Millipore公司）； CO2培養箱（日本SANYO公司，型號：MCO-175）；倒置式基礎型顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：IX51）；酶聯免疫分析儀（美國PerkinElmer公司）；高速低溫離心機（美國ThermoFisher公司，型號：ST-16R）；PB1501-N型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀、Waters SynaptTM High Definition MS(HDMS/MS)System質譜儀、MassLynx V4.1工作站（美國Waters集團公司）；微孔濾器（美國Millipore公司）；多規格培養皿（丹麥Nunc公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

液氮凍存的22RV1人前列腺癌細胞系 37℃水浴快速融化，離心棄上清后細胞以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，于CO2培養箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）內進行培養，次日換液，并于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。當細胞生長至培養貼壁面積的 80%-90%時進行傳遞培養。

2.2 體外腫瘤生長抑制試驗

MTT比色法是用來檢測細胞存活和生長的一種方法。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。利用MTT法檢測木蘭堿是否對22RV1前列腺癌細胞系具有增殖抑制作用，計算其抑制率及IC50值。精密稱定木蘭堿標準品5.48 mg以1 mL DMSO配制成16 mM濃度的母液，避光-20℃冷凍保存。臨用時以RPMI1640培養液稀釋至工作濃度（5、10、20、40、80、160 μM）進行體外增殖抑制作用考察，考察時間設置為24、48、72 h。觀察藥物的體外增殖抑制作用，對照組抑制率為0%。

取對數生長期細胞按適宜密度接種于96孔培養板中，邊緣孔加入200 μL PBS溶液。培養24 h后按組別加入不同濃度的木蘭堿含藥培養液，設置空白培養基對照，每組設置6個平行孔，繼續培養24、48、72 h。到達相應時間后用倒置光學顯微鏡觀察細胞生長狀況及形態改變并拍照記錄。然后先離心棄去培養液，每孔以PBS小心潤洗2-3遍后均加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續培養4 h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 mL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 570 nm處測量各孔的吸光值。實驗重復3次，得到的各個孔吸光度OD值按以下公式計算抑制率：

抑制率%=（1-OD加藥組/OD對照組）×100%用平均抑制率作圖，應用SPSS 19.0軟件計算IC50值。

2.3 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡

凋亡是細胞死亡的一種基本形式，它在胚胎發育、組織分化和一些疾病發生過程中起著重要的調控作用。在該方法中FITC 標記的Annexin V可以用來檢測細胞凋亡。Propidium Iodide（PI）被用來區分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。本文研究木蘭堿對22RV1前列腺癌細胞系是否有誘導凋亡的作用。

調整細胞密度到大約 1×106細胞/mL。將 0.5 mL細胞懸液從細胞培養瓶中（5×105個細胞）轉移到一個干凈的離心管內。加入10 μL培養基結合試劑。加入1.25 μL Annexin V-FITC。室溫（18-24℃）避光反應15 min。室溫1 000×g離心5 min，去除培養基。將細胞用0.5 mL 1×結合緩沖液輕輕重懸。加入10 μL PI。將樣本放置在冰上避光保存。立即用流式細胞儀檢測分析。

2.4 細胞代謝組學樣本制備

取對數生長期細胞按合適密度接種于48孔培養板中，邊緣孔加入200 μL PBS緩沖液。培養24 h后給藥組加入含木蘭堿40 μM的培養液，設置空白培養基對照，每組設置6個平行孔。繼續培養72 h后分別吸取培養液至標記好的、對應的A組潔凈離心管中，4℃、1 500 rpm離心5 min。以胰蛋白酶消化細胞，待細胞開始變圓脫落后終止消化迅速轉移至標記好的、對應的B組潔凈離心管中，4℃、1 500 rpm離心5 min。A、B組均小心棄去上清，以PBS緩沖液合并對應的A、B兩組離心后底層的細胞。以移液器輕輕吹打混勻后4℃、1 500 rpm離心5 min。棄去上清后重復PBS溶液清洗離心步驟一次。再次棄去上清后迅速加入1 mL 20℃冷甲醇淬滅細胞。適當渦旋后將淬滅后的細胞于冰浴下超聲波破碎（20 W，3 min），充分釋放細胞內容物。4℃、10 000 rpm離心15 min后取上清，過0.22 μm微孔濾膜后濾液供代謝組學分析。

2.5 細胞代謝組學數據采集

色譜條件：ACQUITY UPLCTM BEH C18（100 mm ×2.1 mm i.d.，1.7 μm）色譜柱；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣量3 μL。流動相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫條件：0-1 min，1%A；1-2 min，1%-40%A；2-5 min，40%-75%A；5-8 min，75%-99%A。質譜條件：正、負離子模式，毛細管電壓正離子模式3.0 kV，負離子模式2.8 kV；錐孔電壓正離子模式30 V，負離子模式35 V；提取電壓3.0 V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量為50 L·h-1，脫溶劑氣流量600 L·h-1。亮氨酸-腦啡肽（[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.277 1）溶液為鎖定質量溶液。質量掃描范圍：m/z 50-1 000。

2.6 數據處理

利用已建立的分析方法進行樣品正、負離子模式全掃描，得到樣品組個體樣本的內含三維信息的代謝輪廓圖。采用MassLynx V4.1軟件進行色譜峰識別匹配，對數據提取和標準化處理后，利用Ezinfo 2.0軟件首先進行無監督模式的主成分分析（PCA），繪制出反映組間聚集和離散程度的PCA得分圖和3D-PCA得分圖。之后提取空白對照組及72 h給藥時間點樣本數據，進行PCA分析，排除其他因素干擾獲得與藥物作用相關的得分圖。

為了找到對代謝輪廓變化起關鍵性作用的內源性代謝物，對細胞代謝輪廓數據進行配對偏最小二乘判別分析（Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLS-DA）分析，獲得VIPPlot、Loading Plot。離中心越遠的離子對對其分組貢獻越大。結合相關的反應離子貢獻度的變量權重值（VIP）進行分析，在VIP散點圖中，離子碎片呈V型排列，底部離子（VIP值小），對代謝輪廓軌跡產生變化的貢獻率小；頂端離子（VIP值大），對代謝輪廓軌跡產生變化的貢獻率大。在Loading plot中，依據載荷圖中距離遠點越遠，離子對代謝輪廓軌跡產生變化的貢獻越大。同時對各組所獲得計量資料信息數據進行統計學分析，比較兩組間差別是否具有統計學意義，基于P＜0.05作為篩查條件，作為潛在生物標記物集合。為了驗證多維統計中找到的差異物是否在統計上具有顯著差別，使用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，組間比較采用t檢驗，檢驗標志性代謝物組間差異的顯著性。通過代謝物的精確質核比在HMDB＊http∶//www.hmdb.ca/https∶//metlin.scripps.edu/和MTELIN＊＊http∶//www.hmdb.ca/https∶//metlin.scripps.edu/數據庫中搜索可能的結構式進行推測，對由統計學意義的代謝物進行檢索對比，確定差異代謝物及相關代謝途徑。

3 結果

3.1 體外腫瘤生長抑制實驗

MTT實驗顯示，木蘭堿對22RV1前列腺癌細胞系具有一定的增殖抑制作用，在設置的濃度范圍內具有明顯的劑量和時間依賴性：木蘭堿作用濃度較低、作用時間較短時抑制作用較差，隨著劑量和作用時間的增加，抑制作用逐漸增強，48、72 h呈現較為明顯的增殖抑制作用。經計算48 h的木蘭堿IC50值為到73.613 μM；72 h的木蘭堿IC50值達到45.455 μM。以上結果顯示木蘭堿對22RV1人前列腺癌細胞系較強的抗癌活性。詳見表1。

顯微觀察顯示，對照組細胞貼壁良好、延展充分、折光度好，培養基清澈無雜質，可見大量分裂期細胞。而隨著木蘭堿作用時間的延長、濃度的升高，細胞呈現明顯生長抑制狀態：貼壁細胞數量逐漸減少，培養液中密布細胞碎片。剩余貼壁細胞生長狀態較差，間距變大，生長受限，視野少見分裂期細胞。尤其160 μM木蘭堿作用72 h后可見視野中僅剩余少量貼壁細胞且生長狀態很差，多數細胞已經死亡。詳見圖1。

3.2 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡

Annexin V-FITC和PI雙染結果顯示：空白對照組細胞集中分布于流式散點圖左下象限，有極少熒光信號，說明對照組細胞無凋亡情況。而木蘭堿給藥組（160 μM）作用于22RV1前列腺癌細胞系24、48、72 h后，可見凋亡細胞比例逐漸增高并與72 h達到最高62.92%±2.21%（P＜0.01）。上述結果表明木蘭堿能顯著誘導22RV1前列腺癌細胞凋亡的發生，這一點與文獻報道一致。詳見圖2。

3.3 細胞代謝組學分析

圖1 22RV1前列腺癌細胞形態觀察（×100）

表1 木蘭堿對22RV1前列腺癌細胞系增殖抑制作用（n=6）

圖2 木蘭堿誘導前列腺癌細胞系22RV1凋亡作用

圖3 木蘭堿對22RV1前列腺癌細胞系體外增殖抑制作用的代謝組學評價

利用已建立的分析方法進行樣品正、負離子模式全掃描，得到樣品組個體樣本的內含三維信息的代謝輪廓圖。細胞代謝樣本的典型總離子流圖見圖3A。正、負離子模式下的PCA分析結果顯示空白組及木蘭堿組內聚類良好并且在三維空間上組間組分明顯，表明木蘭堿給藥后22RV1前列腺癌細胞系代謝輪廓發生明顯改變（圖3B）。對VIP值貢獻大的潛在生物標記物進行結構解析，確定內源性生物標記物。采用HDMS/MS的方法測定標記物的精確信息，得到測定誤差范圍內相應的可能的化學物分子式；通過分子式及分子質量在HMDB及KEGG等檢索數據庫進行檢索，結合MS/MS選出可能的一種或幾種化合物，最終通過色譜保留行為以及MS/MS數據來確定標記物的化學結構。共鑒定出木蘭堿抗22RV1增殖作用的13個潛在生物標記物，分別為：2-氧代-4硫代甲基丁酸（2-Oxo-4-methylthiobutanoic acid），2,3-亞甲戊二酸 （2,3-Methyleneglutaric acid），s-琥珀酰二氫硫辛酰胺（(S)-Succinyldihydrolipoamide），谷氨酰苯丙氨酸（Glutamylphenylalanine），7-羥基-6-甲基-8-核糖基二氫蝶呤（7-Hydroxy-6-methyl-8-ribityl lumazine），肌醇（Galactinol），泛酸4’-磷酸（D-Pantetheine 4'-phosphate），7-甲基鳥苷5磷酸（7-Methylguanosine 5'-phosphate），環狀磷脂酸(16∶0/0∶0)（CPA(16∶0/0∶0)），溶血磷脂酰膽堿(18∶1(9Z))（LysoPC(18∶1(9Z))），溶血磷脂酰膽堿(18∶0)（LysoPC(18∶0)），尿苷二磷酸乙酰葡萄糖胺（Uridine diphosphate-N-acetylglucosamine），鞘磷脂（d18∶0/16∶1(9Z)）（SM(d18∶0/16∶1(9Z))）。詳見表2。

將鑒定得到的木蘭堿抗前列腺癌相關的生物標記物進行MetPA分析，得到與治療作用密切相關的7個代謝通路，包括淀粉和蔗糖代謝、核黃素代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉換、半乳糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、鞘脂類代謝、精氨酸和脯氨酸代謝。這些結果說明這些內源性代謝產物在整個代謝軌跡中產生了強烈的擾動并且與木蘭堿治療作用密切相關（圖3D）。

4 討論

腫瘤是遺傳事件異常的不良后果，這一觀點得到了廣泛認可[6-9]。基因在系統生物學中處于上游部位，上游的異常經過一系列級聯反應不斷放大最終在多種層面產生一系列復雜后果。腫瘤細胞的代謝重編程包含了能量代謝、核酸代謝、脂肪酸代謝異常等多種事件的顯著改變[10]。代謝組學可以作為癌癥研究的一項有力工具[11]。關黃柏為常用傳統中藥，被《神農本草經》列為上品，關黃柏性味苦寒，清熱瀉火而堅陰“主五臟腸胃中結熱、黃疸、腸痔、止瀉痢、女子漏下赤白、陰傷蝕瘡”[12,13]。關黃柏主要活性成分是生物堿類，被認為是其藥效的主要部分。按照結構可劃分為原小檗堿類生物堿、阿撲嗎啡類生物堿、喹啉類生物堿和單萜吲哚類生物堿[14]。其中木蘭堿屬于阿撲嗎啡類生物堿。生物堿類多數具有生理活性，往往是許多中藥的起效成分[15]。結合細胞生物學藥效學研究部分可以看出，木蘭堿對前列腺癌細胞系22RV1的體外增殖有明確抑制效果。本研究在藥物治療有效的基礎之上，從代謝譜的角度，揭示治療前后，對代謝輪廓的區分影響較大的生物標志物以及相關代謝通路。通過標志物的歸類、比較可以看出，代謝譜作為系統生物學下游的、具有終端表征特點的一類觀察角度，可以很好的反映藥效。

2,3-亞甲戊二酸是支鏈脂肪酸家族的一員。前列腺癌細胞的旺盛增殖和遷移、浸潤需要大量的能量，其能量需求依賴于線粒體脂肪酸β-氧化，即2,3-亞甲戊二酸參與的β-氧化過程很可能是前列腺癌細胞發生、發展過程中的主要能量來源，能夠促進前列腺癌細胞在代謝應激狀態下的存活與增殖[16]。同時腫瘤細胞的大量增殖也需要膜的合成，這一過程同時依賴于脂肪酸的從頭合成過程。因此前列腺癌組織可見明顯的脂類代謝異常，支鏈脂肪酸如∶2,3-亞甲戊二酸的代謝異常介導了前列腺癌細胞的惡性增殖[17]。藥物治療后支鏈脂肪酸的水平降低表明黃柏活性成分木蘭堿能夠抑制前列腺癌細胞系22RV1的能量代謝，從一定程度上逆轉脂肪酸β-氧化代謝的異常，抑制前列腺癌細胞的增殖，促進腫瘤細胞干性丟失。

谷氨酰苯丙氨酸是γ-谷氨酰轉肽酶（Gamma-Glutamyltransferase，γ-GT）這一關鍵酶作用于底物谷胱甘肽及苯丙氨酸的代謝產物。谷氨酰苯丙氨酸水平的異常增高可以反映谷胱甘肽代謝關鍵酶γ-GT活性的異常增高，使得谷胱甘肽經過γ-GT作用與游離氨基酸結合，造成底物耗竭。谷胱甘肽是凋亡小體形成的必要條件之一，內源性谷胱甘肽的含量降低使的其原生的誘導細胞凋亡的效果減弱[18,19]。谷氨酰苯丙氨酸在給藥后顯著降低，可能是木蘭堿能夠抑制γ-GT活性，穩定谷胱甘肽代謝從而改善前列腺癌發生時前列腺功能和癥狀。

7-羥基-6-甲基-8-核糖基二氫蝶呤（7-Hydroxy-6-methyl-8-ribityl lumazine）簡稱CRM，是核黃素代謝的產物，由6,7-二甲基-8-（1-D-核糖基）24

二氫蝶呤（ 6,7-Dimethyl-8-(1-D-ribityl)lumazine，DMDRL）轉化而來。核黃素代謝途徑的生理活性十分廣泛，是許多氧化還原酶系統的輔酶，因而核黃素代謝異常可以影響許多代謝過程的正常進行，如：能量代謝。核黃素穩態增加可能是癌癥發生的一個環節，這一現象有助于增強癌細胞的能量代謝水平從而維持其快速生長和分裂過程[20]。在本實驗中觀察到前列腺癌組由DMDRL轉化為CRM的途徑較給藥治療組為高，而治療后這一情況得到逆轉，由于核黃素代謝途徑影響的廣泛性，多種酶系的異常都可能得到一定程度的糾正，從而起到治療效果。

表2 木蘭堿抗22RV1增殖作用的潛在生物標記物信息

2-氧代-4硫代甲基丁酸（2-Oxo-4-methylthiobutanoic acid，KMTB），是半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑的重要節點物質之一，是甲硫基丙醛的直接前體物質，而研究表明甲硫基丙醛具有強烈的誘導凋亡效果[21]。KMTB同時參與維持細胞膜結構的完整性與穩定性。它可以參與泛酸和輔酶A代謝途徑中重要節點物質硫酸泛酰巰基乙胺（又名泛酸-4-磷酸，D-Pantetheine 4'-phosphate）的合成，后者是泛酸和輔酶A生物合成的主要產物之一。KMTB的顯著降低可能與硫酸泛酰巰基乙胺含量呈現直接相關，木蘭堿給藥組即可觀察到這兩種小分子代謝產物相比前列腺癌組均呈現顯著下降趨勢。給藥后KMTB含量的下降，其直接原因可能是進入下一步合成促凋亡物質甲硫基丙醛合成增多，同時其穩定膜結構功能減弱，從而促進腫瘤細胞凋亡；另外半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑與下游的泛酸及輔酶A代謝有內在聯系，后者直接參與包括能量代謝及多種物質合成反應的酶體系，其缺乏會導致相應輔酶而受限，導致腫瘤細胞增殖障礙，而起到增殖抑制效果。

參與細胞膜結構的磷脂類物質在代謝中會產生許多磷脂代謝產物其中有許多物質屬于重要的信號分子，直接參與細胞生長調控。環狀溶血磷脂酸CPA（16：0/0：0）是溶血磷脂酸類物質的一種，該物質經給藥治療后明顯上升。它對DNA聚合酶有抑制作用的物質，其含量升高可以對腫瘤細胞的遷移及浸潤起到顯著抑制效果，很可能與藥效學形態學觀察時，前列腺癌細胞的貼附以及伸展能力的降低直接相關，在體時應能明顯抑制腫瘤細胞的運動能力，這一作用也可能與CPA（16：0/0：0）參與膜結構運動能力相關[22]。SM（d18：0/16：1(9Z)）、LysoPC（18：0）以及LysoPC（18：1(9Z)）均屬于磷脂代謝的信號物質分子，這些物質的顯著改變表征了磷脂代謝紊亂所導致的細胞生長失調是癌癥進程的一個重要標志。

從以上潛在生物標志物的生物學意義可以看出腫瘤在體內是十分獨立而又獨特的代謝體系，木蘭堿能夠從一定程度上逆轉腫瘤這一代謝體系的代謝重編程過程，有助于腫瘤細胞內異常代謝過程的糾正，從而平衡細胞凋亡逃逸、過度增殖等不良事件。從以上論述還可以看出一個問題，代謝限速酶作為復雜生化反應體系當中的關鍵成員，在代謝的重編程中占有重要地位，影響其下游多種物質的代謝。因此，可以合理推斷木蘭堿對關鍵酶的影響可能是其作用關鍵之一，對關鍵限速酶活性的調節，抑制了包括能量代謝以及腫瘤營養供給等多個節點，造成腫瘤細胞增殖過程中的多個環節向正常組織細胞的方向回調從而產生治療作用。

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Therapeutic Effects of Magnoline Acting as a Potential Effective Component of Phellodendron Amurense Rupr. on Prostate Cancer Based on the Cell Metabolomics

Zhang Tianlei, Qiu Shi, Li Xianna, Zhang Aihua, Sun Hui
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study explored the mechanism behind the inhibitory effects of magnoline on proliferation of human prostate cancer cell line 22RV1 with cell metabolomic technology, for example, the UPLC-HDMS/ MS, based on pharmacodynamics studies of magnoline. The prostate cancer cell line, 22RV1, in the period of logarithmic phase, was inoculated with an appropriate density and divided into the control group and the magnoline group. Compared with those before any treatment, cell morphological changes, cell survival rate, its proliferation, the effectiveness of drug induced apoptosis and its intensity were analyzed after administration, with the cell morphological observation, MTT assay and flow cytometry analysis. On the basis, the antitumor activity of magnoline in prostate cancer was evaluated in vitro in terms of pharmacodynamics. Moreover, the intercellular fluid of prostate cancer cells was extracted to explore the cellular metabolic trajectory with the utilization of high-throughput HPLCMS technology and expounded the differences of endogenous metabolites before and after the administration of magnoline. It was found that magnolia inhibited the proliferation of 22RV1 in a dose and time dependent manner by the apoptosis induction of 22RV1 compared with the control group. And the cells were growing in a state of sickness after administration featuring rare sprinter cells and massive cell debris under the microscope. Furthermore, the cell metabolomic study based on UPLC-HDMS/MS was conducted to reveal the underlying mechanism of pesticide effect. A total of 13 pharmacodynamic biomarkers with the instance of inositol and sphingomyelin were identified. Metpa analysis was applied to find out 7 obviously disturbed metabolic pathways, including starch and sucrose metabolism, riboflavin metabolism, cysteine and methionine metabolism. In conclusion, magnoline suppressed the proliferation of the prostate cancer cell line, 22RV1, in vitro, behind which the potential mechanism was the therapeutic effect of metabolic pathways, such as energenic metabolism and amino acid metabolism. This study elucidated the integral effect of magnoline on treating prostate cancer, which laid a foundation for the development of anti-tumor drugs of prostate cancer with favorable efficacy and less side effect in clinic.

Magnoline, prostate cancer, metabolomics, biomarkers

10.11842/wst.2016.10.013

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-13

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81173500）：基于知柏地黃丸配伍環境的關黃柏治療腎陰虛相火亢盛的藥效物質基礎研究；負責人：孫暉。

＊＊ 通訊作者：孫暉，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥血清藥物化學及中醫方證代謝組學研究。