青錢柳多糖對H4IIE肝細胞胰島素信號傳遞的影響＊

許光遠，孫 文，郭 璇，候 丹，吳麗麗，張 巖，張 茁，張 露，秦靈靈，李 博，李偉笠，劉銅華

（1. 北京中醫藥大學附屬東方醫院 北京 100078；2. 北京中醫藥大學中醫養生學研究所 北京 100029；

3. 陜西中醫藥大學第一臨床醫學院 咸陽 712046；4.北京中醫藥大學科技處 北京 100029；

5. 北京中醫藥大學中藥學院 北京 100029；712046；6. 北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700；7. 北京中醫藥大學研究生院 北京 100078）

青錢柳多糖對H4IIE肝細胞胰島素信號傳遞的影響＊

許光遠1，孫 文2，郭 璇1，候 丹3，吳麗麗2，張 巖1，張 茁3，張 露1，秦靈靈4，李 博5，李偉笠6，劉銅華7＊＊

（1. 北京中醫藥大學附屬東方醫院 北京 100078；2. 北京中醫藥大學中醫養生學研究所 北京 100029；

3. 陜西中醫藥大學第一臨床醫學院 咸陽 712046；4.北京中醫藥大學科技處 北京 100029；

5. 北京中醫藥大學中藥學院 北京 100029；712046；6. 北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700；7. 北京中醫藥大學研究生院 北京 100078）

目的：觀察青錢柳多糖對肝細胞胰島素信號傳導通路關鍵靶點基因、蛋白表達的影響。方法：以H4IIE大鼠肝細胞為模型，培養72 h后，采用Neutral Red法檢測青錢柳多糖（50、100、200、400 μg·mL-1）對細胞活性的影響；根據細胞活性檢測結果分為正常對照組（Control組）、胰島素組（Insulin組）、青錢柳多糖低劑量組（LCP組）和高劑量組（HCP組）；藥物干預2 h后RT-PCR檢測肝細胞相應基因表達，藥物干預30 min后，利用Western blot法檢測肝細胞相應蛋白磷酸化水平。結果：與Control組比較，100、200、400 μg·mL-1青錢柳多糖干預后肝細胞活性顯著升高（P＜0.01）；干預2 h后，LCP組InsR、IRS-2基因表達顯著升高（P＜0.05），Insulin組和HCP組InsR、IRS-2基因表達極顯著升高（P＜0.01）；干預30 min后，Insulin組、HCP組InsR β、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。結論：青錢柳多糖具有增加肝細胞活性作用，其上調肝細胞胰島素信號通路關鍵靶點InsR、IRS-2基因表達，以及InsR β、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平可能是其發揮降糖作用的機制。

青錢柳多糖 H4IIE肝細胞 胰島素信號傳導通路

隨著生活方式的改善，2型糖尿病已成為目前嚴重危害人類健康的慢性疾病之一。據統計，2011年中國糖尿病人數增長速率達到9.7%，居世界首位，遠高于世界平均增長水平6.4%[1]。最新研究數據顯示，中國糖尿病患者中95%以上為2型糖尿病[2]，因此，中國在2型糖尿病防治中面臨巨大壓力。

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal）Ijinskaja系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，是中國特有樹種，其葉具有生津止渴、清熱解毒的功效，被稱為“甜茶”，民間多用于防治糖尿病[3]。現代藥理研究表明，青錢柳含有降糖、降壓、降脂等多種活性物質[4]，其中多糖類在降糖方面功效尤為突出[5]，但作用機制尚不明確。本實驗以H4IIE大鼠肝細胞為模型，觀察青錢柳多糖對其胰島素信號傳導通路關鍵靶點基因、蛋白的影響，以探討青錢柳多糖的降糖機制。

1 材料

1.1 細胞

大鼠肝癌細胞（H4IIE細胞），由日本武庫川女子大學東洋醫藥研究室贈予。常規復蘇細胞，養于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM（1g·L-1葡萄糖）培養基，放入37℃ 5% CO2培養箱中培養。

1.2 儀器

酶標儀GLOMA MULTI DETECTION SYSTEM（美國Promega公司）；PCR擴增儀（ABI Prism 7500）；光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司，BX53型）；垂直電泳儀、轉移槽（美國BIO-RAD公司）；凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司，ChemiDocTMXRS+with Image LabTMSoftware）細胞培養箱（美國Thermo公司，HERA CELL 150i CO2incubator）。

1.3 試藥與藥材

青錢柳葉采自江西修水地區，青錢柳多糖（協和藥物研究所提供，含量約為8.11%，總糖部位多糖含量為75.34%）；FBS胎牛血清（美國gibco公司，批號：1744349）；DMEM培養基（日本京都Nacalai Tesque公司，批號：L4R2552）；諾和靈R生物合成人胰島素注射液（德國諾和諾德公司，批號：批號：國藥準字J20100117）；p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt、β-actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：0011、0008、0005、0003、0014、0020、0013）；Block one（日本京都Nacalai Tesque公司，批號：L4E0085）；Block one-P（日本Nacalai Tesque公司，批號：L5G4440）；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（日本TOYOBO公司）；RNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 藥物提取

干燥的青錢柳葉粉碎成粗粉，用8倍量85%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得醇提浸膏。將醇提浸膏混懸分散于40 L水中，用石油醚以1:1的體積比萃取3次，進行脫脂處理。脫脂處理后，水部分減壓濃縮后進行冷凍干燥得到該部位的干燥粉末。

2.2 H4IIE細胞活性檢測

采用Neutral Red法檢測H4IIE細胞活性。H4IIE細胞培養72 h后（培養基：DMEM+10%FBS+ 1%青-鏈霉素），待細胞長至70%-80%，消化，稀釋為5×104cells·mL-1的細胞懸液，每孔1 mL加入12孔板，按加入不同濃度（50、100、200、400 μg·mL-1）的青錢柳多糖，37℃ 5% CO2培養箱中培養24 h，PBS洗1次，加入50 μg·mL-1中性紅溶液培養3 h，PBS洗1次，加入中性紅溶解劑，540 nm測定OD，計算存活率：存活率=給藥組OD/對照組OD×100%。

2.3 細胞分組與給藥

H4IIE細胞以5×104cell·mL-1濃度接種于12孔板，37℃ 5% CO2培養箱中培養72 h，分為4組，每組3個樣本，分組如下：正常對照組（Control組）：含5%FBS的DMEM；胰島素組（Insulin組）：100 nmol·L-1胰島素+含5%FBS的DMEM；青錢柳多糖低劑量組（LCP組）：200 μg·mL-1CP+含5%FBS的DMEM；青錢柳多糖高劑量組（HCP組）=400 μg·mL-1CP+含5%FBS的DMEM，按實驗需要進行培養。

2.4 H4IIE細胞RT-PCR檢測

給藥干預2 h后H4IIE細胞，PBS洗1次，按照RNA提取試劑盒提取RNA；其次，反轉錄，GoScript?Reverse Transcription System試劑盒進行反轉錄，退火25℃ 5 min，延伸42℃ 1 h，滅活70℃ 15 min，得到cDNA。20 μL反應體系，2 μL cDNA稀釋液加入10 μLGoTaq反應液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7 500 Real Time PCR System進行反應，反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃1 min（共 40 次循環）；95℃15 s，60℃15 s溶解。引物如下：GAPDH上游引物5’- TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3’，下游引物5’-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3’；InsR上游引物5’- TTTGTCATGGATGGAGGCTA -3’，下游引物5’- CCTCATCTTGGGGTTGAACT -3’；IRS-2上游引物5’- TCCTATCCCGAAGAGGGTCT -3’，下游引物5’- TGGGCATATAGCCATCATCA -3’。

2.5 H4IIE細胞Western blot檢測

按分組給藥處理30 min后，以Homoginized Buffer提取總蛋白，加2倍量的上樣緩沖液，100℃5 min 蛋白變性，上樣量每孔20 μg，100 V 2 h電泳，預處理PVDF膜及濾紙，半干法凝膠轉膜，100 A 1 h，膜在TBS溶液中室溫下搖床洗15 min；Blocking one/ Blocking one-P封閉30 min，分別以p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt、β-actin等抗體（1:1 000稀釋）孵育，4℃過夜，洗膜后二抗（1:10 000）孵育，室溫1 h。洗膜后加ECL發光液，室溫反應1 min，凝膠成像系統成像，蛋白條帶用Image J 7.0圖像分析。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件處理數據，數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法；兩組間比較，滿足方差齊性時用 LSD-t 檢驗，不滿足方差齊性時用非參數檢驗；P＜ 0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

3 結果

3.1 不同濃度青錢柳多糖對H4IIE細胞活性的影響

H4IIE肝細胞長至80%-90%，給予不同濃度的青錢柳多糖干預24 h，觀察細胞活性。結果顯示，實驗所選用濃度中，青錢柳多糖無細胞毒作用，并表現出隨濃度升高活性增強的趨勢（P＜0.01）。因此，選擇作用于H4IIE 細胞活性最強的兩個濃度（200、400 μg·mL-1），進行下一步實驗（表1）。

3.2 青錢柳多糖對H4IIE細胞 InsR、IRS-2 mRNA表達的影響

80%-90%H4IIE肝細胞按照分組給藥干預2 h，RT-PCR檢測青錢柳多糖對H4IIE肝細胞InsR、IRS-2 mRNA表達的影響。與Control組相比，Insulin組InsR、IRS-2 mRNA表達顯著上調（P＜0.01），而LCP、HCP組也均顯著上調InsR、IRS-2 mRNA的表達（P＜0.05，P＜0.01），并呈現劑量依賴性升，提示青錢柳多糖能夠上調胰島素信號傳導通路關鍵靶點基因表達（表2）。

3.3 青錢柳多糖對H4IIE細胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響

胰島素信號傳導通路是調節糖代謝的重要途徑，其中InsRβ、IRS-2、Akt是該通路中關鍵靶點蛋白，其磷酸化是該通路發揮作用的重要標志。H4IIE肝細胞按照分組給藥干預30 min后，檢測青錢柳多糖對p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt 蛋白表達的影響。與Control組相比，insulin組InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜ 0.05）；LCP、HCP組也顯著上調InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01），提示青錢柳多糖能夠提高胰島素信號傳導通路靶點蛋白磷酸化水平（表3、圖1）。

4 討論

青錢柳多糖是青錢柳葉水提物中的一類重要生物活性物質，其中含有多種成分，主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖[6]，此外還含有Ca、Al、Mg、K、Fe、Mn、P、Zn、Na、Se、Cr、Pb、Cu等多種微量元素[7]。研究發現，青錢柳多糖具有明確降糖作用[8]，能顯著增加IR-HepG2細胞的糖耗量，改善IR[9]；增加糖尿病小鼠肝糖原合成，抑制糖異生[10]。Kurihara H等[11]通過水煎、冷凍減壓得到青錢柳水提物，以表兒茶素（Epicatechin）作對照，發現其可能通過抑制α-葡萄糖苷酶活性發揮降糖作用。還有研究發現，青錢柳多糖對四氧嘧啶建立的糖尿病小鼠模型胰島細胞具有保護作用[12]。因此，青錢柳多糖具有多途徑降糖作用，但其具體分子作用機制尚不明確。

表1 青錢柳多糖對H4IIE細胞活性的影響(·x ± s，n=5)

表2 青錢柳多糖對H4IIE細胞InsR、IRS-2mRNA表達的影響(·x ± s，n=3)

圖1 青錢柳多糖對H4IIE細胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響

表3 青錢柳多糖對H4IIE細胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響(·x ± s，n=3)

胰島素信號傳導通路是胰島素在調節糖代謝中發揮作用的重要途徑，其信號傳遞減弱或障礙導致胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）發生，血糖升高。肝臟是胰島素作用的主要靶器官之一，肝細胞中胰島素信號傳導的異常對糖代謝產生重要影響。胰島素受體（Insulin Receptor，InsR）包括α和β兩個亞基，胰島素與α亞單位結合后使β亞基構象改變而發生酪氨酸殘基磷酸化，激活InsR[13]。研究發現，抑制InsR的磷酸化，導致IR發生[14]。IRS是胰島素受體底物家族，包括IRS-1、IRS-2、 IRS-3、IRS-4等眾多亞型，其中IRS-2主要在肝臟表達[15]。IRS-2接受激活的InsR刺激后酪氨酸殘基發生磷酸化[16]，從而活化下游分子PI3K、Akt，調節細胞對葡萄糖的攝取以及糖原合成。在胰島素信號傳導通路中InsR、IRS-2、Akt等分子的磷酸化是其活化發揮作用的主要標志，因此，其活化程度反映了胰島素信號的傳遞情況。本研究發現，在青錢柳多糖干預H4IIE細胞24 h后，InsR、IRS-2基因表達較對照組明顯上調；而在青錢柳多糖干預H4IIE細胞30 min后檢測InsRβ、IRS-2、Akt磷酸化水平發現青錢柳多糖高、低劑量組InsRβ、IRS-2、Akt磷酸化水平較對照組明顯上調；這提示青錢柳多糖能夠上調胰島素信號通路上關鍵靶點的基因表達及磷酸化水平，可能是其發揮降糖作用的機制。

綜上所述，青錢柳是民間常用降糖藥物，其多糖成分在既往動物實驗中具有明確的降糖效果，本實驗發現其能夠上調體外培養大鼠肝細胞胰島素信號傳導通路上InsR、IRS-2基因表達和InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平，可能是青錢柳多糖的降糖作用機制，為進一步動物實驗提供依據。

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Impacts of Cyclocarya Paliurus Polysaccharide on Insulin Signaling Pathway in H4IIE Liver Cells

Xu Guangyuan1, Sun Wen2, Guo Xuan1, Hou Dan3, Wu Lili2, Zhang Yan1, Zhang Zhuo3, Zhang Lu1, Qin Lingling4, Li Bo5, Li Weili6, Liu Tonghua7
(1. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
2. Health-Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
3. College of Clinical Medical, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 100029, China;
4. Department of Science and Technology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100028, China;
5. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
6. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China;
7. School of Graduates, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to explore the impacts of Cyclocarya paliurus polysaccharide (CP) on insulin signal pathway in liver cells. H4IIE liver cells of rat that cultivated for 72 h were made up for the model group. H4IIE cells at 70%-80% confluence were exposed to various concentrations of CP, including 50, 100, 200 and 400 μg·mL-1, for measuring cell viability using Neutral Red. Based on the results of cell viability, H4IIE cells were divided into the control group, the insulin group (100 nmol·L-1), the low dose CP group (the LCP group, 200 μg·mL-1) and the high dose CP group (the HCP group, 400 μg·mL-1). After the cultivation of cells for 2 h, mRNA levels were measured by real-time RT-PCR, while phosphorylation levels of target proteins were detected by western blot after the treatment for 30 min. It was found that the cell viability indexes in the cells administered by 100, 200 and 400 μg·mL-1CP increased significantly compared with the control group (P＜0.01). After the administration for 2 h, InsR and IRS-2 mRNA expressions in the insulin group, the LCP group and the HCP group increased (P＜0.05 or P＜0.01). After the administration for 30 min, phosphorylation levels of InsRβ, IRS-2 and Akt in the insulin group were higher than those in the HCP group (P＜0.01). In conclusion, CP probably increased the cell viability of H4IIE cells, and improved the blood glucose index through enhancing the mRNA expressions of InsR and IRS-2 and the phosphorylation levels of InsRβ, IRS-2 and Akt in the liver.

Kyclocarya paliurus polysaccharide, H4IIE liver cell, insulin signaling pathway

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.0010

R587.1

A

2016-07-01

修回日期：2016-07-13

＊ 北京市教育委員會科學研究與研究生培養共建項目-科研項目：中藥干預胰島素抵抗技術平臺建設與方藥篩選研究，負責人：劉銅華。

＊＊ 通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥的臨床和基礎研究。