內皮素A受體拮抗劑BQ-123對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶能力及海馬區神經細胞自噬的影響①

劉俊杰，趙旭，趙雅寧，李建民，徐繼偉

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內皮素A受體拮抗劑BQ-123對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶能力及海馬區神經細胞自噬的影響①

劉俊杰1，趙旭2，趙雅寧1，李建民2，徐繼偉1

[摘要]目的探討BQ-123對蛛網膜下腔出血(SAH)大鼠學習記憶及海馬區神經細胞自噬的影響。方法72只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=24)、SAH模型組(SAH組，n=24)和BQ-123組(n=24)。二次注血法建立大鼠SAH模型，假手術組不注血，BQ-123組于造模前30 min側腦室注射BQ-123 18 μg。分別于術后6 h、24 h、72 h、144 h應用穿梭箱測試大鼠遭受電擊時被動回避潛伏期(PAL)、主動回避反應率(AARR)；HE染色觀察海馬區神經細胞形態變化；免疫組化檢測自噬相關因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達。結果與假手術組比較，SAH組各時間點PAL延長(P<0.05)，AARR降低(P<0.05)，海馬區神經元數量減少(P<0.05)，Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白陽性細胞增加；與SAH組比較，BQ-123組各時間點PAL縮短(P<0.05)，AARR升高(P< 0.05)，海馬區神經元數量增加(P<0.05)，Beclin-1、LC-3-Ⅱ蛋白陽性細胞數增加。結論BQ-123可促進SAH大鼠學習記憶功能恢復，其機制可能與激活海馬區神經細胞自噬有關。

[關鍵詞]蛛網膜下腔出血；BQ-123；學習記憶；自噬；海馬；大鼠

[本文著錄格式]劉俊杰，趙旭，趙雅寧，等.內皮素A受體拮抗劑BQ-123對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶能力及海馬區神經細胞自噬的影響[J].中國康復理論與實踐, 2016, 22(2): 141-145.

CITED AS: Liu JJ, Zhao X, Zhao YN, et al. Effects of endothelin a receptor antagonist BQ-123 on learning and memory ability and neurons autophagy in hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 141-145.

作者單位：1.華北理工大學，河北唐山市063000；2.華北理工大學附屬醫院神經外科，河北唐山市063000。作者簡介：劉俊杰(1990-)，男，漢族，河北保定市人，碩士研究生，主要研究方向：腦損傷與腦保護。通訊作者：李建民，男，博士，主任醫師，主要研究方向：腦損傷與腦保護。E-mail: zyning789@126.com。

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)主要由動脈瘤破裂、先天性動-靜脈畸形及頭部外傷導致，具有非常高的致殘率和死亡率；存活者常遺留學習記憶障礙，嚴重影響患者的生存質量。腦血管痙攣和再破裂出血是被公認的SAH后損傷機制[1-2]。自噬在神經系統疾病的發生發展中發揮著重要作用。研究顯示自噬的激活可以抑制神經細胞的凋亡，減少神經細胞的丟失，而腦血管痙攣又是神經細胞自噬的影響因素之一[3-4]。內皮素受體拮抗劑BQ-123具有高特異性親和力，在血漿中與內皮素競爭性結合內皮素A受體，產生拮抗作用，能降低血管痙攣、抑制交感神經系統及腎素-血管緊張素系統活性[5-6]。

本研究觀察BQ-123對大鼠學習記憶功能及海馬區神經細胞自噬的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠72只，體質量350～450 g，10～12周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2009-003。飼養于華北理工大學動物實驗中心，自由進食水。適應性喂養2周。

所有大鼠依次編號，采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組(Sham組)、SAH組、SAH結合應用內皮素受體拮抗劑組(BQ-123組)，每組各24只。模型完成后，每組任意配伍分為6 h、24 h、72 h、144 h 4個亞組，每個亞組6只。

1.2試劑與儀器

多克隆Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗：美國SANTA CRUZ公司。二抗及其輔助用品：博奧森生物技術有限公司。ZH-CSC型穿梭箱實驗視頻分析系統：安徽正華生物儀器設備有限公司。820-Ⅱ型切片機：德國LEICA公司。TP-1型攤片機：天津天利機電公司。大鼠腦立體定向儀：上海奧爾科特生物科技有限公司。Motic-6.0圖像采集及分析系統、BHS顯微鏡：日本OLYMPUS。攝影生物光學顯微鏡：日本NIKON公司。

1.3模型制備

參考馬朝暉文獻[7]所述，采用經典的自體血二次枕大池注血法(間隔48 h分別向枕大池注射自體動脈血0.3 ml)制備大鼠SAH的模型。造模成功判定標準：①當行二次枕大池注血時，可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出，此現象充分說明穿刺針位置準確；②造模完成3 h內，大鼠頭部CT可見外側裂、鞍上池及側腦橋池CT值較高；③剝離腦部時肉眼可以見到極其顯眼的血性液體散布在腦底基底池部位。

Sham組向枕大池兩次注入0.3 ml生理鹽水，其余操作均與SAH組一致。BQ-123組在模型制備前30 min予以顱骨鉆孔，側腦室定位，然后側腦室注射BQ-123 18 μg，再制備SHA模型。

1.4行為學檢測

各組在相應的時間點分別置入穿梭箱內，暗適應5 min，隨后給予5 s的鈴聲刺激，再立即予以30 s電刺激；間隔20 s行下一次練習。試驗中大鼠受到鈴聲刺激5 s內，能夠迅速逃離危險區，則被界定為1次主動回避反應；大鼠受到鈴聲刺激5 s內未逃離危險區，繼續予以1.5 mA交流電刺激30 s，電擊后大鼠若逃向安全位置記為1次被動回避反應，其余任何反應均為陰性結果。反復記錄30次實驗結果，記錄遭受電擊時被動回避潛伏期(passive avoidance latency, PAL)、主動回避反應次數等參數。系統分析主動回避反應次數占總訓練次數的百分比即為主動回避反應率(active avoidance reaction rate, AARR)。AARR越高，PAL越短，提示動物學習能力越強。

1.5 HE染色

各時間點取5只大鼠，4%多聚甲醛灌注，固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規石蠟包埋，切片(片厚5 μm)HE染色。光學顯微鏡(400×)下觀察海馬CA1區神經元形態變化。每只大鼠取6張海馬CA1區切片，Motic-6.0圖像采集及分析系統記錄高倍視野下存活與壞死神經細胞數量并計算均值。

1.6免疫組織化學染色

切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓熱修復，分別滴加Beclin-1多克隆抗體(濃度1∶200)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(濃度1∶300)，濕盒中4℃過夜；滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。PBS代替一抗陰性對照。光學顯微鏡下(400×)觀察海馬CA1區細胞形態變化；每只大鼠每個因子選3張切片，每張切片在高倍視野鏡下隨機選擇5個不重疊視野(400×)，經BHS顯微鏡計算每個視野的陽性細胞數并計算其均值。

1.7統計學分析

采用SPSS 13.0統計分析軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法或Scheffe法進行組間兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1學習記憶能力

與Sham組比較，SAH組各時間點PAL延長(P< 0.05)，AARR降低(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時間點PAL縮短(P<0.05)，AARR升高(P<0.05)。見表1、表2。

表1　三組大鼠不同時間點PAL比較(s)

表2　三組大鼠不同時間點電擊時AARR比較(%)

2.2 HE染色

Sham組大鼠海馬區神經細胞間排列規整，自身結構完整，細胞核飽滿，核仁清晰可見。SAH組可見神經元部分胞核邊界不清，核固縮、碎裂，核溶解，其中傷后6 h海馬區神經元損傷最嚴重；BQ-123組神經細胞水腫明顯減輕，壞死神經元減少，細胞固縮深染現象減輕。見圖1。

與Sham組比較，SAH組各時間點海馬區神經元數量減少(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時間點海馬區神經元數量增加(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠海馬區神經細胞數量比較(個/高倍視野)

2.3免疫組織化學染色

與Sham組比較，SAH組各時間點的Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白陽性細胞增加(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時間點Beclin-1、LC-3-Ⅱ蛋白陽性細胞數增加(P<0.05)。見表4、表5、圖2、圖3。

表4　各組大鼠海馬區不同時間點Beclin-1蛋白表達(個/高倍視野)

表5　各組大鼠海馬區不同時間點LC3-II表達(個/高倍視野)

圖1　各組6 h海馬區神經元細胞形態變化(HE染色，400×)

圖2　各組24 h海馬區神經元細胞Beclin-1的表達(免疫組化染色，400×)

圖3　各組24 h海馬區神經元細胞LC3-II的表達(免疫組化染色，400×)

3　討論

本研究結果顯示，SAH所導致的腦損傷明顯影響大鼠的學習記憶能力，而應用BQ-123后大鼠的學習記憶功能有明顯改善。學習記憶是腦的高級活動功能，其產生機制目前尚無定論，對于學習記憶能力受損的治療方案也尚不明確。朱杰君等通過Aβ25-35誘導空間學習記憶障礙小鼠模型，發現自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ與小鼠學習記憶存在一定關系[8]。本研究結果發現，SAH組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達升高，自噬明顯被激活，而應用BQ-123干預后，自噬水平較SAH組更為提高，而大鼠的學習記憶功能也隨之升高，與其研究結果一致。

BQ-l23是一類高特異性親和力及水溶性的內皮素受體拮抗劑，在血漿中與內皮素競爭性結合內皮素受體，BQ-123在降低血管痙攣、抑制交感神經系統及腎素-血管緊張素系統活性的過程中，主要通過與內皮素-1產生拮抗而發揮作用[3-4]。姜永生等實驗證實腦損傷疾病中BQ-123在血漿中與內皮素競爭性結合內皮素受體，緩解血管的收縮，抑制血管的痙攣，改善腦組織灌注壓，使細胞的缺血缺氧得到相應的改善，減少外界環境對細胞的應激反應，從而促進神經細胞自噬[9]。Ceylan-Isik等研究發現，內皮素-1能夠降低Beclin-1等自噬相關蛋白的表達，BQ-123的干預可以提高心肌細胞自噬激活的程度[10]。蔡紅法等的研究進一步論證SAH后腦血管痙攣和自噬存在一定的因果關系[11]。本研究結果與此一致。BQ-123拮抗內皮素，使得鈣離子釋放減少，保證腦組織的血供[12]。內皮素-1通過與內皮素B受體結合，釋放內源性NO，進一步緩解血管收縮，舒張血管，緩解腦組織的缺血缺氧。我們推測，BQ-123可能通過該機制提高神經細胞自噬水平進而提高學習記憶功能。

本研究還通過病理學染色發現，BQ-123組海馬CA1區存活神經細胞的數量明顯比SAH組多。前期研究已經證實，自噬對神經細胞的存活有保護作用。因此，本研究認為BQ-123干預后可能通過緩解腦血管痙攣而提高神經細胞自噬水平，進而減少海馬區神經細胞丟失，改善學習記憶功能。

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Effects of Endothelin A Receptor Antagonist BQ-123 on Learning and Memory Ability and Neurons Autophagy in Hippocampus in Rats with Subarachnoid Hemorrhage

LIU Jun-jie1, ZHAO Xu2, ZHAO Ya-ning1, LI Jian-min2, XU Ji-wei1
1.North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China; 2.Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Correspondence to LI Jian-min. E-mail: zyning789@126.com

Abstract:Objective To investigate the effect of BQ-123 on the ability of learning and memory and nerve cell autophagy in hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods 72 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, SAH model group (SAH group) and BQ-123 group with 24 rats in each group. SAH model was established by injecting the autologous blood into cisterna magna twice. The sham group was not injected blood. BQ-123 group received intracerebroventricular injection with BQ-123 18 μg 30 minutes before modeling. 6, 24, 72 and 144 hours after modeling, the passive avoidance latency (PAL) and active avoidance reaction rate (AARR) were tested with Shutter Box Test, the nerve cell morphological changes of hippocampus were observed with HE staining, and the expressions of Beclin-1 and LC3-II were detected with immunohistochemical staining. Results Compared with the sham group, the PAL prolonged, the AARR decreased (P<0.05), the nerve cells in the hippocampus reduced (P<0.05), and the expressions of Beclin-1 and LC3-II increased (P<0.05) in SAH group. Compared with SAH group, PAL shortened (P<0.05), AARR increased (P<0.05), the nerve cells in the hippocampus increased (P<0.05), and the expressions of Beclin-1 and LC3-II increased (P<0.05) in BQ-123 group. Conclusion BQ-123 can promote the recovery of learning and memory ability, which may relate to the activation of nerve cell autophagy in the hippocampus.

Key words:subarachnoid hemorrhage; BQ-123; learning and memory; autophagy; hippocampus; rats

(收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-21)

基金項目：河北省重大醫學課題(No.ZD2013093)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.004

[中圖分類號]R743.35

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)02-0141-05