熱射病對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力遠(yuǎn)期損害的研究①

張云，萬明勝，董會，吳士文

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熱射病對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力遠(yuǎn)期損害的研究①

張云1,2，萬明勝3，董會1，吳士文2

[摘要]目的比較熱射病大鼠不同階段的空間學(xué)習(xí)記憶能力，探討其遠(yuǎn)期影響。方法Sprague-Dawley大鼠42只，建立熱射病大鼠模型，將造模成功后的大鼠隨機(jī)分為熱射病7 d組(HS7，n=21)和熱射病21 d組(HS21，n=21)；另取18只大鼠麻醉后行股動脈插管作為手術(shù)對照組(Sham，n=18)。3組分別于造模后7 d、21 d行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)5 d，記錄逃避潛伏期，跨越平臺的次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間。結(jié)果逃避潛伏期各個時間點(diǎn)HS7組均較Sham組延長(P<0.05)；第4、5天，HS21組較Sham組延長(P<0.05)；第3、4、5天，HS21組較HS7組縮短(P<0.05)。目標(biāo)象限停留時間HS7組較Sham組縮短(P<0.05)；HS21組較HS7組延長(P<0.05)。穿越平臺次數(shù)HS7組和HS21組較Sham組減少(P<0.05)；HS21組與HS7組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論熱射病大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙在發(fā)病7 d后最嚴(yán)重，并可遺留遠(yuǎn)期損害。

[關(guān)鍵詞]熱射病；空間學(xué)習(xí)記憶；Morris水迷宮；遠(yuǎn)期損害；大鼠

[本文著錄格式]張云，萬明勝，董會，等.熱射病對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力遠(yuǎn)期損害的研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(2): 146-149.

CITED AS: Zhang Y, Wan MS, Dong H, et al. Long-term impairment of spatial learning and memory in rats after heat stroke [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 146-149.

作者單位：1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)市453000；2.武警總醫(yī)院，北京市100039；3.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥市230000。作者簡介：張云(1989-)，男，漢族，河南偃師市人，碩士研究生，主要研究方向：熱射病認(rèn)知功能損傷研究。通訊作者:吳士文，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:wu_shiwen@yahoo.com; neurowu@gmail.com。

熱射病(heat stroke, HS)是中暑最嚴(yán)重的類型，為致命性急癥，臨床表現(xiàn)為核心體溫升高至40℃以上及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，甚至可并發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)而危及生命。近年來研究報道不少熱射病患者遺留有嚴(yán)重的后遺癥，尤其是神經(jīng)功能缺損，如小腦及認(rèn)知功能損害[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)熱射病大鼠7 d后空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退[18]，但是這種空間學(xué)習(xí)記憶障礙是否呈持久性，以及發(fā)病不同階段空間學(xué)習(xí)記憶能力的差別，目前仍缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究建立熱射病大鼠模型，應(yīng)用Morris水迷宮檢測熱射病大鼠7 d及21 d后的空間學(xué)習(xí)記憶能力，探討熱射病大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的遠(yuǎn)期損害。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠80只，體質(zhì)量260～300 g，購自維通利華生物公司，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2012-0001。每5只一籠，室溫維持在(25±0.5)℃，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)環(huán)境3 d。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

PowerLab/4SP多通道生理記錄儀：澳大利亞ADINSTRUMENTS公司。XMZ404電子溫度傳感器、動脈壓力傳感器、Morris水迷宮跟蹤系統(tǒng)：北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。戊巴比妥鈉：美國SIGMA公司。肝素鈉注射液：萬邦制藥。

1.3造模及分組

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定于操作臺。取62只大鼠行股動脈插管，連接三通，通過多通道生理記錄儀監(jiān)測心電、平均動脈壓；肛門插入電子溫度探頭監(jiān)測深部直腸溫度，置于溫、濕度控制箱中，設(shè)定溫濕度調(diào)節(jié)點(diǎn)為(39.5±0.2)℃，濕度13.5%，當(dāng)箱內(nèi)溫度或濕度高于此調(diào)定點(diǎn)時，燈泡自動關(guān)閉；當(dāng)箱內(nèi)溫度或濕度低于此調(diào)定點(diǎn)時，則可觸發(fā)繼續(xù)加熱或加濕。當(dāng)實(shí)驗(yàn)大鼠核心體溫>42℃且平均動脈壓降至50 mmHg左右，視為發(fā)生熱射病。立即取出大鼠并給予4℃涼水沖洗10 min。蘇醒后單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后第1個24 h脫脂奶粉灌胃2 ml/h，自主進(jìn)食糊狀飼料，24 h后自由進(jìn)食進(jìn)水。

共20只大鼠在造模后24 h內(nèi)死亡，將造模成功的42只大鼠隨機(jī)分為熱射病7 d組(HS7，n=21)和熱射病21 d組(HS21，n=21)。

另取18只大鼠麻醉后行股動脈插管(方法同HS 組)作為手術(shù)對照組(Sham，n=18)，監(jiān)測心電及動脈壓，置于(22±0.5)℃、濕度25%的環(huán)境中，維持核心體溫(34±1)℃。蘇醒后單獨(dú)飼養(yǎng)，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

1.4 Morris水迷宮測試

HS7組和HS21組分別于造模后對應(yīng)時間行Morris水迷宮測試。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.4.1定位航行實(shí)驗(yàn)

將大鼠頭朝池壁按東、西、南、北4個入水點(diǎn)放入水池中，水迷宮錄像系統(tǒng)記錄大鼠自入水至找到并爬上平臺的時間作為逃避潛伏期。大鼠找到并爬上平臺后，將其留在平臺30 s。如果大鼠在120 s之內(nèi)找不到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺并停留30 s，潛伏期記錄為120 s。每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔2 h。將4次訓(xùn)練的潛伏期平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績計入統(tǒng)計。共訓(xùn)練5 d。

1.4.2空間探索實(shí)驗(yàn)

在最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤去平臺，將大鼠任選1個入水點(diǎn)放入水中，所有大鼠為同一入水點(diǎn)，自由游泳120 s，每只大鼠進(jìn)行1次，記錄大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1定位航行實(shí)驗(yàn)

各個時間點(diǎn)HS7組逃避潛伏期均較Sham組延長(P<0.05)。第1、2、3天，HS21組和Sham組逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)；第4、5天，HS21組較Sham組延長(P<0.05)。第1、2天，HS21組和HS7組逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)；第3、4、5天，HS21組較HS7組潛伏期縮短(P<0.05)。見表1。

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)

HS7組目標(biāo)象限停留時間較Sham組縮短(P< 0.05)；HS21組與Sham組無顯著性差異(P>0.05)；HS21組較HS7組延長(P<0.05)。HS7組和HS21組穿越平臺次數(shù)較Sham組減少(P<0.05)；HS21組與HS7組無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較(s)

表2　各組大鼠Morris水迷宮測試空間探索實(shí)驗(yàn)比較

3　討論

熱射病是一種危及生命的急癥，其典型癥狀為體溫升高超過40℃、大量出汗、心動過速、低血壓及伴隨的精神癥狀，嚴(yán)重時可出現(xiàn)全身循環(huán)衰竭、多器官功能障礙以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害是熱射病初期的主要癥候群，可見行為異常、抽搐及不同程度的意識障礙(包括昏迷、嗜睡、譫妄等)。熱射病神經(jīng)功能損害可依據(jù)發(fā)生的時間順序分為3個階段：急性期、恢復(fù)期和永久性損害[2]。急性期以突然發(fā)生的意識障礙、抽搐和精神異常為特點(diǎn)[3]；在恢復(fù)期可出現(xiàn)短暫的神經(jīng)功能缺失，包括易怒、注意力不集中、定向障礙、譫妄、短暫的步態(tài)和小腦損害體征[4]；永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要包括小腦性共濟(jì)失調(diào)、構(gòu)音障礙和錐體束征等[5-6]。

早期人們對熱射病永久性神經(jīng)功能缺失的認(rèn)識存在很多爭論，Mehta等在1969年研究認(rèn)為熱射病患者長期后遺癥并不常見，多數(shù)能夠完全康復(fù)[7]。然而隨著研究的進(jìn)展，越來越多的病例報道表明熱射病后可出現(xiàn)神經(jīng)功能永久性損傷。據(jù)統(tǒng)計，在1～2年的隨訪中，大約76%～100%的熱射病幸存者會遺留持久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[8]，在這些神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥中小腦損害體征占主要部分[9-10]。然而臨床上很少對熱射病患者進(jìn)行認(rèn)知功能評估和長期隨訪，多數(shù)患者遺留的認(rèn)知功能損害常常被忽略，僅少量文獻(xiàn)報道，熱射病后存在一過性或長期認(rèn)知功能后遺癥狀，輕者表現(xiàn)為記憶力下降、注意力不集中，重者則表現(xiàn)為全面癡呆[11-13]。

Morris水迷宮是用于研究大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的裝置，被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、缺血性癡呆、智力與衰老、行為生物學(xué)等方面的研究，目前最常用的評價指標(biāo)是定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期和空間探索實(shí)驗(yàn)的穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間[14]。

本研究通過建立熱射病大鼠模型，應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)生熱射病后7 d及21 d的空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示熱射病大鼠7 d時空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷最重，21 d后仍存在空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙，但較7 d好轉(zhuǎn)。提示熱射病可能造成持久的認(rèn)知功能損害。

熱射病患者是否遺留后遺癥主要取決于高熱持續(xù)的時間、休克的嚴(yán)重程度、降溫治療是否及時和徹底以及并發(fā)癥的診斷和治療[15]。熱射病后的認(rèn)知功能損害可有多種表現(xiàn)形式，包括記憶損傷、精神障礙、性格改變甚至癡呆等[16]。目前，臨床報道多例與熱射病相關(guān)的記憶損傷的病例。1993年Axelrod等報道2例熱射病患者在發(fā)病3年后仍表現(xiàn)為全面的記憶減退，同時并發(fā)左側(cè)偏癱或失語癥[13]。2013年Cha等報道1例臨床表現(xiàn)為選擇性順行性遺忘的熱射病患者，9個月后，患者順行性遺忘仍存在[17]。Romero等報道2例熱射病后記憶減退的患者，其中1例患者3周后的神經(jīng)心理學(xué)評估顯示嚴(yán)重的記憶缺陷，另1例為影像學(xué)正常的緩慢的記憶力減退[11]。但是由于缺乏對熱射病患者的長期隨訪，臨床中多數(shù)患者認(rèn)知功能損害的長期預(yù)后并不清楚。

我們前期對熱射病大鼠7 d后的空間學(xué)習(xí)記憶障礙進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熱射病大鼠7 d后空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退[18]。小腦運(yùn)動行為學(xué)的步態(tài)分析顯示熱射病大鼠第1、7、21天均存在步態(tài)異常，提示熱射病可存在遠(yuǎn)期的小腦功能障礙[19]。近年來的研究也證實(shí)小腦參與非運(yùn)動性高級認(rèn)知功能，病理研究也發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，小腦浦肯野細(xì)胞皺縮、變性等病理損害[20]。

目前研究發(fā)現(xiàn)熱射病神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制主要包括高熱直接損傷、腦血流量減少、全身炎癥反應(yīng)、自由基損傷、內(nèi)皮素增加及多種神經(jīng)遞質(zhì)改變[21]。Cabanac研究發(fā)現(xiàn)體溫超過40.5℃，大腦皮層及神經(jīng)中樞就會造成不可逆的永久性損傷[22]。炎性因子的釋放引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，破壞血腦屏障，導(dǎo)致血管源性水腫，進(jìn)而可導(dǎo)致大腦缺血缺氧并發(fā)生細(xì)胞毒性水腫，造成神經(jīng)細(xì)胞永久性損傷[23-24]。海馬是大腦邊緣葉的重要組成部分，與認(rèn)知功能有密切關(guān)系。高溫環(huán)境下，皮質(zhì)類固醇激素及其受體、各種神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞黏附分子等在海馬學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。熱射病永久性的認(rèn)知功能損害與海馬、小腦及其他腦區(qū)的關(guān)系及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過觀察比較熱射病大鼠7 d 及21 d后的空間學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)現(xiàn)熱射病可遺留遠(yuǎn)期認(rèn)知功能損害。這提示我們應(yīng)該重視熱射病患者的神經(jīng)心理學(xué)評估及長期隨訪，在熱射病急性恢復(fù)期幾周后詳細(xì)的神經(jīng)心理學(xué)評估可以深刻了解患者持續(xù)殘留的認(rèn)識功能和情感缺陷[25]，也可以為今后患者及其家庭的康復(fù)治療提供重要的臨床參考，成為評估患者是否可以再次工作及重返社會的依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Mégarbane B, Résière D, Shabafrouz K, et al. Descriptive study of the patients admitted to an intensive care unit during the heat wave of August 2003 in France [J]. Presse Med, 2003, 32(36): 1690-1698.

[2] Bouchama A, Knochel JP. Heat stroke [J]. N Engl J Med, 2002, 346(25): 1978-1988.

[3] Epstein Y, Moran DS, Shapiro Y, et al. Exertional heat stroke: a case series [J]. Med Sci Sports Exerc, 1999, 31(2): 224-228.

[4] Adams T, Stacey E, Stacey S, et al. Exertional heat stroke [J]. Br J Hosp Med (Lond), 2012, 73(2): 72-78.

[5] Chang CP, Chen SH, Lin MT. Ipsapirone and ketanserin protects against circulatory shock, intracranial hypertension, and cerebral ischemia during heat stroke [J]. Shock, 2005, 24(4): 336-340.

[6] Lin MT, Kao TY, Jin YT, et al. Interleukin-1 receptor antagonist attenuates the heat stroke-induced neuronal damage by reducing the cerebral ischemia in rats [J]. Brain Res Bull, 1995, 37(6): 595-598.

[7] Mehta AC, Baker RN. Persistent neurological deficits in heat stroke [J]. Neurology, 1970, 20(4): 336-340.

[8] Leon LR, Bouchama A. Heat stroke [J]. Compr Physiol, 2015, 5 (2): 611-647.

[9] Albukrek D, Bakon M, Moran DS, et al. Heat-stroke-Induced cerebellar atrophy: clinical course, CT and MRI findings [J]. Neuroradiology, 1997, 39(3): 195-197.

[10] Yaqub BA. Neurologic manifestations of heatstroke at the Mecca pilgrimage [J]. Neurology, 1987, 37(6): 1004-1006.

[11] Romero JJ, Clement PF, Belden C. Neuropsychological sequelae of heat stroke:report of three cases and discussion [J]. Mil Med, 2000, 165(6): 500-503.

[12] Rav-Acha M, Shuvy M, Hagag S, et al. Unique persistent neurological sequelae of heat stroke [J]. Mil Med, 2007, 172(6): 603-606.

[13] Axelrod BN, Woodard JL. Neuropsychological sequelae of heatstroke [J]. Int J Neurosci, 1993, 70(3-4): 223-232.

[14]封敏,盧圣鋒,張承舜,等.國內(nèi)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀與分析[J].遼寧中醫(yī)雜志, 2011, 38(11): 2170-2172.

[15] Shapiro Y, Seidman DS. Field and clinical observations of exertional heat stroke patients [J]. Med Sci Sports Exerc, 1990, 22 (1): 6-14.

[16] Hancock PA, Vasmatzidis I. Effects of heat stress on cognitive performance: the current state of knowledge [J]. Int J Hyperthermia, 2003, 19(3): 355-372.

[17] Cha SY, Kang TH, Kim SJ, et al. Selective anterograde amnesia associated with hippocampal and splenial damage after heat stroke [J]. Clin Neurol Neurosurg, 2013, 115(9): 1867-1870.

[18]張進(jìn)進(jìn),王恒,房效利,等.熱射病大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(3): 272-275.

[19]王恒,沈麗娜,張進(jìn)進(jìn),等.熱射病大鼠CatWalk運(yùn)動行為學(xué)研究[J].臨床誤診誤治, 2015, 28(4): 113-116.

[20]吳士文.熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京:軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院, 2010.

[21] Chen SH, Lin MT, Chang CP. Ischemic and oxidative damage to the hypothalamus may be responsible for heat stroke [J]. Curr Neuropharmacol, 2013, 11(2): 129-140.

[22] Cabanac M, White M. Heat loss from the upper airways and selective brain cooling in humans [J]. Ann N YAcad Sci, 1997, 813: 613-616.

[23] Reynolds LP, Allen GV. A review of heat shock protein induction following cerebellar injury [J]. Cerebellum, 2003, 2(3): 171-177.

[24] Yamakawa K, Matsumoto N, Imamura Y, et al. Electrical vagus nerve stimulation attenuates systemic inflammation and improves survival in a rat heatstroke model [J]. PLoS One, 2013, 8(2): e56728.

[25] Royburt M, Epstein Y, Solomon Z, et al. Long-term psychological and physiological effects of heat stroke [J]. Physiol Behav, 1993, 54(2): 265-267.

·基礎(chǔ)研究·

Long-term Impairment of Spatial Learning and Memory in Rats after Heat Stroke

ZHANG Yun1,2, WAN Ming-sheng3, DONG Hui1, WU Shi-wen2
1. Xinxiang Medical University, Xinxiang, Henan 453000, China; 2.The General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 3.Anhui Medical University, Hefei,Anhui 230000, China

Correspondence to WU Shi-wen. E-mail: wu_shiwen@yahoo.com; neurowu@gmail.com

Abstract:Objective To compare the spatial learning and memory function of heat stroke rats in different periods, to explore the long-term impairment. Methods 42 Sprague-Dawley rats were randomly divided into heat stroke 7 days group (HS7, n=21), heat stroke 21 days group (HS21, n=21), and another 18 rats were performed femoral artery intubation as surgery control group (sham, n=18). They were tested with Morris water maze 7 days and 21 days after modeling respectively for 5 days. The escaping latency, the frequency of crossing the platform area and the duration in the target quadrant were recorded. Results Compared with the sham group, the escaping latency prolonged in HS7group in all the time (P<0.05), and 4th and 5th days in HS21group (P<0.05). Compared with HS7group, the escaping latency shortened in HS21group on the 3rd, 4th and 5th days (P<0.05). The duration in the target quadrant shortened in HS7group compared with the sham group (P<0.05), and prolonged in HS21group compared with HS7group (P<0.05). The frequency of crossing the platform decreased both in HS7group and HS21group compared with the sham group (P<0.05), and no difference was found between the later 2 groups (P> 0.05). Conclusion The impairment of spatial learning and memory is the most seriously 7 days after heat stroke in rats, and it may remain for long time.

Key words:heat stroke; spatial learning and memory; Morris water maze; long-term impairment; rats

(收稿日期：2015-12-04修回日期：2015-12-17)

基金項(xiàng)目：國家發(fā)改委衛(wèi)星專項(xiàng)基金項(xiàng)目(No.發(fā)改辦高技[2013]2140)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.005

[中圖分類號]R594.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)02-0146-04