靶向哺乳動物細胞線粒體的核酸轉運

付愛玲

(西南大學藥學院，重慶　400716)

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靶向哺乳動物細胞線粒體的核酸轉運

付愛玲

(西南大學藥學院，重慶400716)

中國圖書分類號: R-05; R329. 24; R342. 2; R342. 3; R589. 9; R977. 6

摘要:線粒體DNA( mitochondrial DNA，mtDNA)的遺傳性突變和缺陷是多種線粒體功能失調相關疾病的根本原因。靶向線粒體遞送核酸，可從根本上糾正mtDNA突變、挽救mtDNA損傷、阻斷疾病進程。哺乳細胞內線粒體的核酸轉運途徑與細胞核的基因轉染大不相同。該文綜述了向哺乳動物細胞線粒體遞送DNA和RNA( tRNA、rRNA、mRNA和反義RNA)的有效策略，并對其存在問題和發展趨勢做一闡述。

關鍵詞:線粒體轉導;靶向序列;核酸轉運;線粒體相關疾病; tRNA載體; 5s rRNA轉導;穿梭蛋白

線粒體是哺乳動物中唯一具有核外DNA的細胞器，它保留著自身完整的一套遺傳系統，為氧化磷酸化相關復合物的生成提供必需的多肽和蛋白質。哺乳動物線粒體DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA)長度為16．5 kbp，共編碼13個與氧化磷酸化有關的多肽和蛋白質、22個tRNA和2個rRNA，不包含基因間隔區和內含子［1］。

哺乳動物mtDNA突變顯然對宿主細胞有明顯的不良影響，并且大量的事實已證明線粒體基因組突變是引發多種疾病的主要原因［2］:在人類mtDNA中，已確定超過300個突變與疾病的發生有關( http: / /www．mitomap．org)，如神經和肌肉退行性病變、心肌疾病、腫瘤、糖尿病和病理性衰老等［3］。常見的突變包括編碼蛋白的基因反義突變、tRNA和rRNA基因點突變、基因復制或刪除等等［4］。一般認為，當野生型和突變的mtDNA的比例達到一定的閾值時，就會出現臨床癥狀［5］。

靶向線粒體基因組的核酸轉運是治療線粒體疾病的一個有效方法。線粒體進行DNA轉染的主要困難是它的雙層膜、體積小、數量大。為避開線粒體轉染的難題，人們曾嘗試間接蛋白質轉導這一替代方法:通過質粒或病毒轉染細胞，使細胞核表達由于mtDNA致病突變而缺乏的蛋白質，再經線粒體靶向序列將表達的蛋白質運輸到線粒體［6］。盡管這一間接方法可能會得到令人鼓舞的結果，向線粒體遞送核酸可從根本上糾正mtDNA突變、挽救mtDNA損傷、阻斷疾病進程。已建立的方法主要有線粒體轉導、載體介導、靶向肽或靶向序列引導、穿梭蛋白介導核酸進入細胞線粒體;此外，將外源RNA插入rRNA或tRNA中，根據線粒體對胞質內RNA的攝取作用，可將外源的RNA轉運至線粒體內( Fig 1)。向線粒體內轉運核酸仍處于當今研究的前沿。

Fig 1 Strategies of delivery of nucleic acid into mammalian mitochondria．Nucleic acids are transported mainly by exogenous mitochondria，carrier，targeted-peptides or sequences，and shuttle protein．Also，rRNA and tRNA can be used as carriers for delivering exogenous nucleic acids into mitochondria．

1　向細胞內遞送mtDNA

1．1整個線粒體轉導在正常狀態下，哺乳動物和植物細胞的線粒體極少從胞質中直接攝取DNA，因此常規的細胞轉染方法不能使DNA進入線粒體。而單細胞生物酵母和萊茵衣藻不同，它們的線粒體可從胞質中攝取少量的DNA。

在早期的研究中，Clark等［7］將分離的線粒體( mtDNA中含有抗生素耐受性序列)與哺乳細胞共孵育，得到了抗生素耐受性的細胞，表明分離純化的線粒體可直接被細胞內吞，并在胞質中發揮作用，從而使原本對抗生素敏感的細胞對抗生素產生了耐受性。然而，在以后的25年內，一直沒有人關注這個發現。直至Katrangi等［8］報道了將分離的正常線粒體與去除線粒體的人A549肺癌細胞一起孵育，正常線粒體被細胞所攝取，從而恢復了細胞的呼吸鏈。在最近的報道中，為提高線粒體進入細胞的效率，將細胞穿透肽Pep-1連接到分離的野生型線粒體(活力約為83. 5%)表面，加入到肌陣攣性癲癇伴蓬毛樣紅纖維綜合癥病人的細胞中，結果顯示在給予線粒體3 d后，細胞的線粒體功能得到了恢復，包括恢復了氧化磷酸化亞單位(復合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ)的活性、線粒體膜電位和ATP的生成量，同時降低了活性氧自由基的產生［9］。

此外，將外源線粒體顯微注射到細胞內，可導致外源線粒體快速取代細胞自身的線粒體。這個方法可用于改善受精卵線粒體功能的研究。由于哺乳動物的受精卵線粒體來源于母系，母系線粒體中的遺傳突變將傳遞給下一代，因此線粒體替代的方法可能會對母系遺傳疾病有一定的治療作用。研究表明，將分離的線粒體顯微注射到小鼠受精卵中，在胚胎發育的第一階段可檢測到外源線粒體和mtDNA［10－11］，然而，隨后其水平大幅下降，其機制尚不清楚。

1．2重組DNA的線粒體轉導在驗證外源線粒體替代的同時，研究還發現了線性DNA可直接進入分離的線粒體。在缺乏任何人工手段下，線狀的裸DNA可主動進入分離的植物、動物和真菌線粒體中［12］。此外，外源DNA進入線粒體后，可進行轉錄和表達，并且一些損傷的DNA在進入植物和動物線粒體后也可被修復。已知細胞核基因組在細胞DNA轉染時，對DNA的序列和長度有所限制，但分離的人線粒體對線性DNA的長度和序列無選擇性。

環狀DNA(質粒)可通過電穿孔的方式進入線粒體。在生理條件下，電穿孔可引發哺乳動物、原生生物或植物中分離的線粒體對DNA的攝取。Yoon等［13］將來源于大腸桿菌的DNA中增加了一個轉導起始區( origin of transfer，oriT)序列，然后將其轉染入分離的線粒體，當把線粒體與活細胞孵育后，重組的DNA可在活細胞的線粒體內進行表達。

此外，有人在無復制性的大腸桿菌中構建哺乳動物的全部mtDNA，將這種含有mtDNA的大腸桿菌介導至體外培養的哺乳動物細胞質中，使克隆的mtDNA與細胞本身的線粒體mtDNA對接。這種由大腸桿菌介導的mtDNA重組的方法也能得到設計的mtDNA［14］。

1．3線粒體靶向序列引導DNA進入向線粒體與整個線粒體轉導的研究相反，通過線粒體靶向序列或靶向肽將DNA轉運進入線粒體，這些研究開展較早、進展較快，并仍在持續進行。

已知由細胞核指導的線粒體前體蛋白在合成后，在N末端帶有線粒體靶向序列。該序列通過線粒體的蛋白導入途徑，引導蛋白質進入線粒體。常用的線粒體靶向序列有細胞色素氧化酶亞基8前體蛋白N末端的23個氨基酸( MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPR)等［15］。線粒體靶向序列也可引導其他分子(核酸、納米顆粒、脂質體)等進入線粒體。

將線粒體靶向肽的N末端與17個或322個堿基對的DNA回文序列連接，連接物也可進入分離的大鼠肝線粒體中。在另外的體系中，線粒體靶向肽與肽核酸的一個片段連接，復合物可進入分離的哺乳動物細胞線粒體中。近期研究表明，線粒體靶向肽與結合DNA的PEI偶聯，多肽/PEI/ DNA復合物可定位在活細胞的線粒體［16］。然而，該方法存在的問題是DNA與多肽的連接物不易合成，且易于水解，此外，線粒體靶向序列引導其他物質雖然可進入線粒體，但可能難以通透細胞膜，因此，需其他有效的途徑彌補這個方法的缺陷。

為解決線粒體靶向序列與DNA的連接物可能難以進入細胞的問題，進一步開發了“轉導載體”復合物。該復合物包含了細胞穿透肽［17－18］、線粒體靶向肽和線粒體轉錄因子A( TFAM)或mtDNA結合因子。其中后者可與DNA非共價結合，細胞穿透肽引導復合物進入細胞。而線粒體靶向肽引導復合物進入線粒體。這個復合物曾用于向帕金森病模型細胞的線粒體運送DNA，結果表明轉導載體和DNA的共定位于線粒體，并阻斷了線粒體損傷［19］。此外，使用轉導載體將正常的mtDNA運輸進含有突變mtDNA的人類細胞，線粒體的功能可部分恢復。如果通過轉導載體將致病的mtDNA介導入人神經祖細胞，外源致病的mtDNA也可在線粒體中表達。

1．4納米載體介導DNA進入線粒體設計的非陽離子脂質體載體MITO-porter能夠用于向線粒體輸送DNA［20］。MITO-porter是一個內核含有運輸的藥物，外層分別為線粒體融合層和內吞體融合層的納米顆粒。MITO-porter經內吞進入細胞后，外層分別通過與內吞體膜和線粒體膜融合，以膜融合的方式攜帶藥物進入活細胞線粒體基質中［21］。

有些雙性載體也能夠通過線粒體膜并聚集在線粒體內(如三苯基膦)，這些載體可用于向線粒體內轉運DNA。雙性載體可通透脂質雙層膜進入線粒體中。將PNA寡聚體與之共價連接后，在膜電勢驅動下，雙性載體將PNA攜帶進入培養的人細胞的線粒體。此外，絲氨酸衍生的雙性表面活性劑/DNA復合物也可經內吞機制進入細胞后，轉染50%以上細胞的線粒體［22］。

2　輸送tRNA進入線粒體

盡管正常細胞的線粒體很少從胞質中攝取DNA，但在大多數物種中，線粒體可天然地從胞質中攝取RNAs，其中最常見的是tRNA。這是由于線粒體的基因組并不編碼完整的一套tRNA，因此線粒體就需分享胞質翻譯系統中核編碼的tRNAs。不同物種能夠轉導進線粒體的tRNAs數量不同，例如有袋動物的線粒體僅可轉導進一個tRNAs，而錐蟲線粒體可轉導進所有tRNAs［23］。tRNAs進入線粒體的機制極可能是非特異tRNA導入復合體( tRNA import complex，RIC)途徑。

2．1細胞核異位表達治療線粒體疾病的tRNAs人類有些線粒體疾病是由于編碼tRNA基因的mtDNA發生了突變，因此由細胞核編碼并從胞質內補充功能性的tRNA，可能會有效抑制mtDNA的無義突變。以往以為，人類細胞的線粒體可編碼自身所有的tRNA，直至在體外實驗發現它們還可攝取酵母胞質的tRNAslys( CUU)及其變異體，隨后實驗也證明了人類線粒體可天然攝取胞質的tRNAGln，表明了人類線粒體至少也保持了攝取tRNAs的能力。

肌陣攣性癲癇伴蓬毛樣紅纖維綜合癥的主要病因是人成纖維細胞中mtDNA編碼Lys的tRNA基因發生了點突變。將來源于釀酒酵母的tRNAslys衍生物轉導進入tRNAlys8344 A＞G突變的人成纖維細胞的線粒體［24］，當該異源的tRNAslys轉導進入線粒體后，可參與線粒體內翻譯，部分糾正了由于mtDNA突變引起的功能性損傷。相似的方法也用于糾正線粒體tRNAleu3243 A＞G突變引起的另一個惡性疾病——線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作綜合征［25］。

2．2設計的tRNA作為載體向線粒體轉運核酸線粒體對天然tRNAs的攝取激發了tRNA是否可作為靶向載體的研究。已知錐蟲的所有線粒體均可從胞質中攝取tRNAs(包括tRNATyr前體)，而tRNA前體包含了11個核苷酸的內含子，因此將此內含子用合成的外源38個核苷酸的序列取代，得到的tRNATyr變異體可轉導進入轉基因的利士曼原蟲( leishmania tarentolae)線粒體中。這個結果提示，天然tRNA的變異體可作為載體，包埋在tRNA的小RNA隨之進入人類細胞，從而抑制突變mtDNA的翻譯。

3　向線粒體內遞送反義RNA

使用MITO-Porter系統，將針對細胞色素c氧化酶亞基Ⅱ(線粒體呼吸鏈的組分之一)的反義RNA寡核苷酸( antisense RNA oligonucleotide，ASO)轉運到線粒體。在線粒體內，ASO選擇性敲除了細胞色素C氧化酶亞基II的mRNA和蛋白，同時ASO通過下調呼吸鏈，線粒體膜電位去極化。這是首次報道的納米載體介導反義RNA靶向線粒體基因組，從而調節線粒體功能［26］。

熱帶利什曼原蟲寄生原蟲中的RIC是輔助tRNA進入線粒體的必需載體。最近采用該RIC為載體，快速并有效地將反義RNA或DNA轉導進入培養的人細胞線粒體中，結果顯示反義RNA可特異性誘導靶向的線粒體mRNA降解并影響下游的呼吸作用，說明RIC可用于向完整細胞的細胞器中靶向遞送治療性的RNA［27］。

4　rRNA作為核酸載體

5s rRNA是所有活細胞生物核糖體的基本組成成分，但線粒體基因組中并不包含5s rRNA基因，因此大量核編碼的5s rRNA可天然從胞質進入線粒體，避開傳統的核仁導入途徑。其中線粒體的5s rRNA導入因子硫氰酸酶和線粒體核糖體蛋白L18可能起重要作用［28］。在線粒體中，5s rRNA與核糖體相互作用，并對線粒體的蛋白質翻譯有重要作用。

以5s rRNA為載體，使其攜帶針對mtDNA目的序列的互補DNA寡核苷酸，可對mtDNA進行熒光雜交。其中使用可與DNA結合的Alexa Fluor? 488或647熒光染料作為寡核苷酸標記探針。探針在5s rRNA載體的作用下，進入到HepG2細胞的線粒體基質中，與互補的mtDNA序列結合［29］。

在分析人5s rRNA被線粒體攝取的機制時，發現去掉β區并不影響其攝取，因此考慮使用人工設計的序列取代這個區域。例如，用13個核苷酸外源序列取代這個區域，衍生的5s rRNA變異體可進入人類細胞線粒體中。此外，該方法可將反基因組的寡核苷酸靶向性運送入線粒體，阻斷人類細胞中帶病理突變mtDNA的復制。這個方法還可將突變mtDNA的拷貝數降低到產生疾病的閾值以下。

5　穿梭蛋白輸送mRNA進入線粒體

人們曾研究使用穿梭蛋白攜帶RNA靶向進入線粒體，其中氨基酰化tRNA合成酶已用于線粒體tRNA的輸入。但這種特異的RNA結合蛋白轉運tRNA轉進入線粒體的效率較低。在哺乳動物細胞中，存在一種RNA結合蛋白——二氫葉酸還原酶( dihydrofolate reductase，DHFR)［30］。哺乳動物的DHFR可在體內天然結合自身的底物mRNA，若與線粒體靶向序列連接后，可實現對RNA的轉運。在分離的植物線粒體，DHFR可通過共轉運的方式高效地將tRNA和長片段RNA轉運進線粒體，包括延長的tRNA前體或全長的線粒體mRNA(不含任何tRNA成分)。此外，兩個不同的全長mRNAs也可由DHFR轉運到分離的哺乳動物線粒體。該方法可成為向植物和哺乳動物線粒體內高效轉運長片段RNAs的方法。

6　結語與展望

向線粒體內補充核酸是治療線粒體疾病的清晰途徑。采用線粒體靶向序列、納米載體或脂質體可將DNA轉導到線粒體中，并且由于線粒體使用的是非通用遺傳密碼，DNA中的密碼子只要能夠被線粒體核糖體閱讀，就能夠進行轉錄和翻譯。但外源DNA與mtDNA的重組部位和機制尚需進一步闡明。

除了DNA轉染外，RNA轉運也將對線粒體遺傳學帶來重大進展。由于哺乳動物線粒體在進化過程中仍保留了對RNAs攝取的能力，可通過直接轉運tRNAs或5s rRNA，以補充線粒體中相關RNA的缺失而治療疾病。此外，將RNAs前體中的內含子用小片段RNA替代，RNAs前體進入線粒體后，小片段RNA被剪切并釋放出來，用于糾正DNA突變。同時，全長mRNA的線粒體轉運也可在穿梭蛋白的協助下進行。總之，完善和發展線粒體核酸治療技術，可糾正線粒體遺傳缺陷和損傷，最終實現對線粒體疾病的治療。

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Targeting delivery nucleic acid into mammalian mitochondria

FU Ai-ling
( College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400716，China)

Abstract:Mitochondrial DNA ( mtDNA) genome mutations and defects are the essential mechanism of a various of mitochondrial dysfunction associated with diseases．The studies of targeting delivery nucleic acid into mammalian mitochondria can thoroughly correct mtDNA mutation，rescue mtDNA impairment and then reverse the progress of diseases．There’s obvious differences between nucleic acid import pathway of mammalian mitochondria and gene transfection of nuclei．In this paper，the effective strategies of delivering DNA and RNA( tRNA，rRNA，mRNA and antisense RNA) into mitochondria have been reviewed，as well as the challenges and development．

Key words:mitochondrial transduction; targeting sequence; nucleic acid transfer; mitochondria-associated diseases; tRNA carrier; 5s rRNA transduction; shuttle protein

作者簡介:付愛玲( 1973－)，女，博士，教授，研究方向:神經藥理學、生物化學和分子生物學，Tel/Fax: 023-68251225，E-mail: fuailing1008@ hotmail．com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 81273416) ;教育部高校基本科研業務費( No XDJK2013A030) ;教育部回國人員啟動基金;教育部新世紀優秀人才支持計劃資助

收稿日期:2015－10－05，修回日期: 2015－11－26

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0001－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．001