膽汁酸膜受體TGR5對高糖培養的大鼠腎小球系膜細胞FN、TGF-β1的調控作用

熊鳳霄，楊志英，王少貴，陳　誠，黃河清

(中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東廣州　510006)

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膽汁酸膜受體TGR5對高糖培養的大鼠腎小球系膜細胞FN、TGF-β1的調控作用

熊鳳霄，楊志英，王少貴，陳誠，黃河清

(中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東廣州510006)

中國圖書分類號: R-332; R322．61; R341; R692．39; R977. 6

摘要:目的探究G蛋白偶聯受體TGR5在大鼠腎小球系膜細胞中的表達以及高糖條件下對纖維連接蛋白( fibronectin，FN)以及轉化生長因子( transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白水平的影響，探索其在糖尿病腎病中可能發揮的作用。方法高糖( 30 mmol·L－1glucose，HG)條件下，用特異性激動劑INT-777激活TGR5，或者對TGR5進行過表達、干擾處理，通過Western blot來檢測大鼠腎小球系膜細胞中TGR5的表達情況以及FN、TGF-β1蛋白水平的變化。結果

在大鼠腎小球系膜細胞中存在TGR5的表達;與對照組相比，激活TGR5后，由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的上升受到抑制( P＜0. 01，P＜0. 05) ;另一方面，干擾TGR5后，FN、TGF-β1的蛋白水平與對照組相比異常升高，差異有統計學意義( P＜0. 01，P＜0. 05)。結論在大鼠腎小球系膜細胞中，TGR5可以抑制由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的升高，在糖尿病腎病的發生發展中可能發揮保護作用。

關鍵詞:G蛋白偶聯受體; TGR5;高糖;腎小球系膜細胞;纖維連接蛋白;轉化生長因子; INT－777;糖尿病腎病

黃河清( 1965－)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:中藥心血管及糖尿病藥理學，通訊作者，E-mail: huangheq @ mail．sysu．edu．cn

TGR5，也稱M-BAR、GPBAR或者GPR131。由330個氨基酸組成，包含7個跨膜結構域，屬于G蛋白偶聯受體家族成員，是一種新型膽汁酸受體［1］。近年研究發現，激活TGR5可以減少巨噬細胞炎癥反應，抑制單核細胞中促炎癥因子的表達［2－3］，另外，還可以促進胰高血糖素樣肽-1( GLP-1)的分泌，使胰島素水平增加［4］，調控能量代謝相關基因的表達，改善胰島素抵抗等［5］。TGR5在炎癥、糖脂代謝等方面均有非常重要的調節作用，但目前尚未見它在糖尿病腎病方面的報道。

糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發癥，是終末期腎病發生的主要原因。病理特征主要表現為腎臟纖維化、系膜細胞增生、細胞外基質的堆積以及系膜區增寬等［6］。纖維連接蛋白( fibronectin，FN)是細胞外基質的重要組成部分，能有效反映其堆積程度［7－8］;而轉化生長因子TGF-β1可以促進胞外基質的合成，加速腎臟纖維化［9－10］，兩者都是糖尿病腎病的重要指標。

為此，實驗以大鼠腎小球系膜細胞為研究對象，予以高糖刺激模擬糖尿病腎病的體內環境，檢測了TGR5的表達情況，并運用特異性激動劑INT-777激活TGR5，或者使用過表達、干擾TGR5的方法，檢測FN、TGF-β1的變化，進而探索TGR5在糖尿病腎病中發揮的作用。

1　材料與方法

1．1細胞的傳代和培養大鼠腎小球系膜細胞的原代分離培養按以前的實驗方法進行［11］。細胞鑒定后，取5～12代的細胞進行實驗。培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃，5% CO2，每2 ～3 d使用5%胰酶消化傳代。細胞生長至匯合時，用無血清培養基處理24 h，之后再予以不同的分組處理。

1．2實驗試劑D－( + )－葡萄糖和胰蛋白酶( Sigma) ;胎牛血清( HyClone) ; DMEM培養基( Gibco) ;識別FN，TGR5的抗體( Santa Cruz Biotechnology)，識別TGF-β1的抗體( Cell Signaling Technology)和識別α-tubulin的抗體( Sigma) ;辣根過氧化物酶偶合的兔、鼠二抗( Promega) ; INT-777( MedChem Express)。

1．3質粒的轉染質粒TGR5以及空載購自Origene。將系膜細胞接種至培養皿中常規培養，細胞生長近融合至60%～80%時，即可開始轉染實驗。轉染試劑按LipofectamineTMLTX＆Plus Reagent( Life Technologies)的說明書進行使用。轉染24 h后，無血清培養24 h，使細胞同步化，再給予高糖和INT-777刺激24 h，收集細胞用于Western blot檢測。

1．4TGR5干擾實驗消化重懸的系膜細胞接種至培養皿中常規培養，細胞生長近融合至60%～80%時即可開始干擾實驗。干擾序列購自Genepharma，正義鏈5'-GCUUCUUUCUAAGCCUACUTT-3';反義鏈5'-AGUAGGCUUAGAAAGAAGCTT-3'。干擾試劑按LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent( Life Technologies)的說明書進行使用。48 h后收集細胞用于Western blot檢測。

1．5Werstern blot檢測大鼠腎小球系膜細胞FN以及TGF-β1的蛋白水平細胞終止培養后，棄培養基，在冰上用預冷的PBS漂洗2次，棄去PBS，加去污裂解液，刮下細胞收集裂解液至1. 5 mL EP管，裂解完畢后離心取上清，用BCA法測定蛋白含量。之后將提取蛋白進行凝膠電泳，每個泳道上樣量為20 μg總蛋白。電泳結束后，電轉至PVDF膜或者NC膜( Millipore)上。一抗4℃孵育12～16 h，之后分別用對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。洗膜后曝光，顯影。利用圖像分析軟件Quantity One( Bio-Rad)確定目的條帶的光密度值。

1．6統計學分析數據采用Graphpad Prism 5. 0進行分析，組間比較、組內比較用t檢驗，多組比較用方差分析(單因素方差分析、LSD法)，結果用±s表示。

2　結果

2．1TGR5在大鼠腎小球系膜細胞的表達從Fig 1可以看出，大鼠腎小球系膜細胞中存在TGR5的表達，為進一步實驗提供了基礎。與正常對照組相比，高糖組TGR5的蛋白表達水平下降，提示TGR5可能參與了糖尿病腎病的發展進程，具體作用有待進一步探討。

2．2特異性激動TGR5對于大鼠腎小球系膜細胞中FN及TGF-β1的影響INT-777是TGR5的一種特異性激動劑［12］。如Fig 2所示，與正常對照組相比，高糖組的FN及TGF-β1蛋白水平均明顯上升。在此基礎上加入特異性激動劑INT-777(終濃度為10 μmol·L－1)處理，FN蛋白水平下調( P＜0. 01)，TGF-β1的表達也明顯減少( P＜0. 05)。由此可見，激動TGR5可以抑制由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的異常升高。

Fig 1 Protein level of TGR5 in rat glomerular mesangial cells

Fig 2 Effects of INT-777 on protein expression of FN and TGF-β1 in high glucose-treated rat glomerular mesangial cells

2．3過表達TGR5對于大鼠腎小球系膜細胞中FN及TGF-β1的影響為進一步確定TGR5發揮的作用，采用TGR5過表達的方法，并于過表達后進一步予以INT-777刺激來檢測FN及TGF-β1的表達情況。從Fig 3A可以看出，與對照組相比，過表達組的TGR5蛋白表達明顯升高( P＜0. 05)。如Fig 3B-C所示，與高糖組相比，TGR5過表達組的FN、TGF-β1的蛋白水平已經有下降的趨勢。在此基礎上予以INT-777刺激，FN與TGF-β1的蛋白水平均更進一步下調( P＜0. 01，P＜0. 05)。

2．4干擾TGR5對于大鼠腎小球系膜細胞中FN 及TGF-β1的影響另一方面，對TGR5進行干擾，以驗證它對于FN及TGF-β1的調控作用。從Fig 4A中可以看出，TGR5干擾序列的干擾效率達到70%。如Fig 4B-C所示，與對照組相比，干擾TGR5后，FN及TGF-β1的蛋白水平均異常升高( P＜0. 01，P＜0. 05)，遠高于正常水平，說明TGR5在腎小球系膜細胞中確實可以阻止FN、TGF-β1的蛋白異常表達。

3　討論

Fig 3 Effects of TGR5 overpression on protein expression of FN and TGF-β1 in high glucose-treated rat glomerular mesangial cells

Fig 4 Effects of TGR5 knockdown on protein expression of FN and TGF-β1 in rat glomerular mesangial cells

大量研究表明，高糖可以導致轉化生長因子的增加，促進胞外基質的堆積，是糖尿病腎病發生的重要原因［9，13］。大鼠腎小球系膜細胞是腎小球的主要功能細胞［14］，細胞外基質的產生、細胞因子的分泌等都與之有關，在腎臟的生理功能和組織結構的維護中有著重要作用［8］。在糖尿病狀態下，大鼠腎小球系膜細胞中轉化生長因子TGF-β1等細胞因子的表達增加、FN等細胞外基質的大量積聚，促進腎臟纖維化，導致系膜區擴張，促成了糖尿病腎病的病理變化［7，9］。本研究利用高糖培養大鼠腎小球系膜細胞，FN及TGF-β1的蛋白水平相對于正常對照組明顯上升，成功模擬了體內糖尿病腎病的環境。

TGR5可以被一定濃度范圍內的鵝去氧膽酸( CDCA)，石膽酸( LCA)，膽酸( CA)，脫氧膽酸( DCA)等激活，但均無較好的特異性［15］。本研究采用半合成膽酸衍生物INT-777作為TGR5的激動劑，它毒性低，有較高的效價和選擇特異性，可以排除膽汁酸核受體FXR的影響［12］。此外，我們使用了過表達的方法，并在此基礎上再次使用該激動劑，進一步增強了TGR5的功能，有效地降低了由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平升高，而干擾TGR5引起這些指標的異常上升則從功能缺失的角度更好地突顯了TGR5對于FN、TGF-β1蛋白表達的抑制作用。

對于糖尿病腎病的治療，目前多采取控制血糖、調節血脂等方法進行綜合治療，缺乏特異有效的方法。采取有針對性的方法阻止糖尿病腎病的發生，探討其有效靶點，具有重要的意義。近年來發現，膽汁酸受體不僅參與膽汁酸的合成與代謝，而且在糖脂代謝以及能量消耗中也發揮著重要的調節作用［1］。TGR5作為一種新型膽汁酸膜受體，其發揮的生理功能有待積極探索。本研究在大鼠腎小球系膜細胞中檢測到了TGR5的表達，并在使用不同方法干預TGR5之后，檢測了糖尿病腎病進程中的重要指標FN、TGF-β1的表達變化，證實了TGR5可以抑制高糖狀態下這兩者的異常升高，在糖尿病腎病進程中可能發揮著重要的保護作用，有望成為該疾病的新靶標，為治療提供了新的思路。

(致謝:本研究在中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室完成，實驗室老師和同學在課題的設計、實驗的具體操作上均給予了大力的支持與幫助，在此表示衷心的感謝! )

參考文獻

［1］Pols T W，Noriega L G，Nomura M，et al．The bile acid membrane receptor TGR5 as an emerging target in metabolism and inflammation［J］．J Hepatol，2011，54( 6) : 1263－72．

［2］Pols TW，Nomura M，Harach T，et al．TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation and lipid loading［J］．Cell Metab，2011，14( 6) : 747－57．

［3］Hogenauer K，Arista L，Schmiedeberg N，et al．G-protein-coupled bile acid receptor 1 ( GPBAR1，TGR5) agonists reduce the production of proinflammatory cytokines and stabilize the alternative macrophage phenotype［J］．J Med Chem，2014，57( 24) : 10343－54．

［4］Thomas C，Gioiello A，Noriega L，et al．TGR5-mediated bile acid sensing controls glucose homeostasis［J］．Cell Metab，2009，10 ( 3) : 167－77．

［5］Watanabe M，Houten S M，Mataki C，et al．Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid hormone activation［J］．Nature，2006，439( 7075) : 484－9．

［6］Kanwar Y S，Sun L，Xie P，et al．A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］．Annu Rev Pathol，2011，6: 395－423．

［7］李學娟，陳澤彬，魏紅，等．大黃素對高糖培養的GMC增殖、FN表達及p38MAPK的影響［J］．中國藥理學通報，2014，30( 2) : 233－8．

［7］Li X J，Chen Z B，Wei H，et al．Effects of emodin on cell proliferation，FN expression and p38MAPK pathway in rat mesangial cells cultured under high glucose［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 2) : 233－8．

［8］Huang K，Huang J，Xie X，et al．Sirt1 resists advanced glycation end products-induced expressions of fibronectin and TGF-beta1 by activating the Nrf2/ARE pathway in glomerular mesangial cells ［J］．Free Radic Biol Med，2013，65: 528－40．

［9］Xie X，Xia W，Fei X，et al．Relaxin inhibits high glucose-induced matrix accumulation in human mesangial cells by interfering with TGF-beta1 production and mesangial cells phenotypic transition［J］．Biol Pharm Bull，2015，38( 10) : 1464－9．

［10］余敏，周宏灝，劉昭前．糖尿病腎病相關基因研究進展［J］．中國藥理學通報，2008，24( 11) : 1419－22．

［10］Yu M，Zhou H H，Liu Z Q．Progress in related genes of diabetic nephropathy［J］．Chin Pharmacol Bull，2008，24( 11) : 1419－22．

［11］Geoffroy K，Wiernsperger N，laqarde M，E1 Bawab S．Bimodal effect of advanced glycation end products on mesangial cell proliferation is mediated by neutral ceramidase regulation and endogenous sphingolipids［J］．J Biological Chem，2004，279 ( 33) : 34343－52．

［12］Pellicciari R，Gioiello A，Macchiarulo A，et al．Discovery of 6alpha-ethyl-23( S) -methylcholic acid ( S-EMCA，INT-777) as a potent and selective agonist for the TGR5 receptor，a novel target for diabesity［J］．J Med Chem，2009，52( 24) : 7958－61．

［13］劉慰華，劉世明，林雙峰，等．黃連素通過S1P2-MAPK信號通路抗糖尿病腎纖維化作用機制研究［J］．中國藥理學通報，2013，29( 5) : 723-728．

［13］Liu W H，Liu S M，Lin S F，et al．Role of berberine in fibronectin expression via S1P2-MAPK signaling pathway in diabetic nephropathy［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29( 5) : 723－8．

［14］Cove-Smith A，Hendry B M．The regulation of mesangial cell proliferation［J］．Nephron Exp Nephrol，2008，108( 4) : e74－9．

［15］Stepanov V，Stankov K，Mikov M．The bile acid membrane receptor TGR5: a novel pharmacological target in metabolic，inflammatory and neoplastic disorders［J］．J Recept Signal Transduct Res，2013，33( 4) : 213－23．

Regulatory effects of the bile acid membrane receptor TGR5 on FN and TGF-β1 in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose condition

XIONG Feng-xiao，YANG Zhi-ying，WANG Shao-gui，CHEN Cheng，HUANG He-qing
( Laboratory of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Science of Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510006，China)

Abstract:AimTo investigate the expression of G protein-coupled receptor TGR5 and its effects on FN and TGF-β1 expression cultured under high glucose condition in rat glomerular mesangial cells，and then tobook=37,ebook=46explore the role of TGR5 in diabetic nephropathy．Methods INT-777 and TGR5 plasmid were used to activate TGR5 under high glucose( HG，30 mmol·L－1glucose) condition，and anti-TGR5 small interfering RNA( TGR5 siRNA) was used to knock down TGR5．The protein expression of FN and TGF-β1 in rat mesangial cells was detected by Western blot．Results TGR5 could be detected in rat glomerular mesangial cells．Both FN and TGF-β1 protein levels could be increased by high glucose compared with control group( P＜0. 05)，and be inhibited by activiation of TGR5( P＜0. 05)．On the other hand，knockdown of TGR5 could increase FN and TGF-β1 protein to abnormal levels( P ＜0. 01，P＜0. 05)．ConclusionTGR5 suppresses HG-induced FN and TGF-β1 expression in rat glomerular mesangial cells，suggesting a protective role in the process of diabetic nephropathy．

Key words:G protein-coupled receptor; TGR5; high glucose; glomerular mesangial cells; fibronectin; transforming growth factor-β1; INT-777; diabetic nephropathy

作者簡介:熊鳳霄( 1990－)，女，碩士生，研究方向:中藥心血管及糖尿病藥理學，E-mail: xiongfx@ mail2．sysu．edu．cn;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 81373457) ;教育部博士點基金資助項目( No 20130171110097) ;廣東省自然科學基金資助項目( No S2013010015765，S2012020010991)

收稿日期:2015－09－16，修回日期: 2015－11－26

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0033－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．008