Sorting nexin 10缺失對小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響

李婉貞，游　艷，彭　錦，周　春，李　東，沈曉燕，2

( 1．中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東廣州　510006;2．復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海　201203)

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Sorting nexin 10缺失對小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響

李婉貞1，游艷1，彭錦1，周春1，李東1，沈曉燕1，2

( 1．中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東廣州510006;2．復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海201203)

中國圖書分類號: R-332; R329．24; R341; R392. 12; R977. 6

摘要:目的內(nèi)涵體/溶酶體轉(zhuǎn)運對巨噬細(xì)胞處理病原體和炎癥應(yīng)答等功能至關(guān)重要。該研究探討了內(nèi)涵體/溶酶體轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白SNX10對巨噬細(xì)胞功能的影響，為治療多種巨噬細(xì)胞相關(guān)免疫疾病提供新的潛在靶點。方法PCR反應(yīng)鑒定小鼠基因型;激光共聚焦檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能;慶大霉素保護實驗檢測巨噬細(xì)胞的殺菌功能; RT-q-PCR法檢測TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6的表達(dá)水平; ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6的表達(dá); Western blot和免疫熒光染色檢測NF-κB通路;脂多糖( lipopolysaccharides，LPS)刺激巨噬細(xì)胞炎癥化。結(jié)果SNX10敲除后對其吞噬功能沒有影響，但能夠增強巨噬細(xì)胞的殺菌能力;同時SNX10缺失還可以抑制巨噬細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α、IL-12/23 p40和IL-6，抑制NF-κB信號通路。結(jié)論SNX10敲除增強了巨噬細(xì)胞的殺菌能力，同時可以抑制巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答，其作用機制可能是通過NF-κB信號途徑而實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞:SNX10;巨噬細(xì)胞;細(xì)胞因子;殺菌; TNF-α; IL-12/23 p40; IL-6; NF-κB

沈曉燕( 1968－)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:藥物藥理與毒理學(xué)，通訊作者，Tel: 021-51980182，E-mail: shxiaoy@ fudan．edu．cn

分揀連接蛋白家族( sorting nexins，SNXs)是一個進化上保守的磷酸肌醇結(jié)合蛋白大家族，迄今已發(fā)現(xiàn)34個成員，該家族成員均具有與磷酸肌醇結(jié)合的PX域，SNXs通過PX與磷酸肌醇的結(jié)合錨定到內(nèi)涵體膜上。通過蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)－脂相互作用參與內(nèi)體囊泡運載物分揀和膜轉(zhuǎn)運［1－4］。SNX10是SNXs家族成員中結(jié)構(gòu)最簡單的一類蛋白，在內(nèi)涵體/溶酶體的膜轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。目前對于它在破骨細(xì)胞活化中的功能研究已有多篇報道［5，11］。由于內(nèi)涵體/溶酶體轉(zhuǎn)運對巨噬細(xì)胞吞噬和消化病原體、處理與呈遞抗原、炎癥應(yīng)答、以及維持組織穩(wěn)態(tài)等功能至關(guān)重要，我們推測SNX10很可能對巨噬細(xì)胞的功能具有調(diào)控作用。

本研究利用SNX10基因敲除鼠，通過測定骨髓來源巨噬細(xì)胞的殺菌能力、吞噬能力、TNF-α、IL-12/ 23 p40、IL-6等細(xì)胞因子的分泌、以及NF-κB信號通路活化等相關(guān)指標(biāo)，研究SNX10敲除后對骨髓巨噬細(xì)胞功能的影響，為闡明SNX10的功能提供了新的依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物與試劑SNX10基因敲除小鼠購自復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所;熒光微球及LPS購自美國Sigma-Aldrich公司;人源重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF購自Peprotech公司; TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6 ELISA試劑盒購自深圳達(dá)科為公司; RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及抗生素購自Gibco公司;引物購自Invitrogen公司; TRIzol、RT-q-PCR試劑盒購自TaKaRa公司;抗體GAPDH、β-actin、IκB、p65購自CST公司。

1．1．2儀器雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司) ;二氧化碳培養(yǎng)箱( Thermo Electron) ;激光共聚焦系統(tǒng)( Zeiss 710，ZEISS) ;定量PCR儀( Bio-Rad) ;凝膠成像系統(tǒng)( Bio-Rad) ; PCR擴增儀( Bio-Rad)。

1．2方法

1．2．1小鼠鑒定哺乳期滿且經(jīng)過分籠后的小鼠，剪下小鼠尾尖部約0. 7 cm，置于EP管中，每個EP管中加入180 μL裂解液A和20 μL蛋白酶K充分渦旋混勻，置于55℃水浴鍋中消化過夜。后續(xù)步驟具體方法按照碧云天基因組DNA小抽提試劑盒說明書進行操作。以純化后的總DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并拍照保存。

1．2．2小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng)取5～6周齡♂小鼠，頸椎脫臼處死，置于75%酒精中浸泡消毒3～5 min。分離股骨與脛骨，去除肌肉組織，用剪刀剪開兩端骨垢端，用1 mL注射器將骨髓沖出，100μm過篩，1 000×g離心5 min，棄上清，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個cells·L－1，并加入10－5mg·L－1M-CSF，種板，于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2 d換1次液。

1．2．3細(xì)胞培養(yǎng)RAW264. 7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞做實驗。

1．2．4吞噬實驗將骨髓巨噬細(xì)胞種于含有玻片的小皿中，分3組，M-CSF刺激7 d后，用預(yù)冷的PBS洗3次，根據(jù)使用說明加入熒光微球，混勻后于冰上放置5 min后，再置于37℃孵箱孵育30 min，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠巨噬細(xì)胞對熒光微球的吞噬情況。

1．2．5慶大霉素保護實驗接種細(xì)胞于12孔板，分兩組，即WT組、SNX10敲除組，每組3個復(fù)孔。按照Larous FS［6］的步驟:將細(xì)菌與細(xì)胞按10∶1比率混合后置于37℃培養(yǎng)箱中共同孵育1 h，棄去培養(yǎng)上清，用100 mg·L－1慶大霉素作用1 h，清除胞外細(xì)菌，隨后改用10 mg·L－1慶大霉素作用，于37℃分別孵育2、6、24 h，于相應(yīng)時間點，收集細(xì)胞裂解液。PBS清洗細(xì)胞3次，用0. 5%的Triton X-100室溫裂解15 min，用無菌PBS稀釋成不同倍數(shù)，涂皿，37℃倒置24 h，計算菌落數(shù)。

1．2．6 TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6轉(zhuǎn)錄水平測定采用實時定量PCR( real time PCR)。將小鼠骨髓巨噬細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于d 8用1 μg·L－1LPS刺激24 h后，按照TaKaRa試劑盒說明書，提取細(xì)胞總RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄。Real Time PCR反應(yīng)體系為: SYBY Premix Ex Taq II 12. 5 μL;無RNase水8. 5 μL;上下游引物各1 μL; cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序為: 95℃5min、95℃30s、60℃30s ; 40循環(huán)。

1．2．7 TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6表達(dá)水平的檢測將小鼠骨髓巨噬細(xì)胞種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組為WT、KO、WT + LPS、KO + LPS培養(yǎng)7 d后，無血清培養(yǎng)4 h后，在WT + LPS、KO + LPS組加入1 mg· L－1的LPS孵育24 h，細(xì)胞經(jīng)處理完畢后，離心收集上清。按照深圳達(dá)科為的ELISA試劑盒說明書檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子。

1．2．8Western blot檢測細(xì)胞蛋白變化按照“1. 2. 4”將小鼠骨髓巨噬細(xì)胞種于6孔板，分別給予1 μmol·L－1LPS刺激1 h和24 h后，分別提取核蛋白和總蛋白，分別用Bradford法和BCA法定量。分裝蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量大小配置分離膠和濃縮膠，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。將NC膜置于含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉1 h，4℃孵育IκB、p65一抗過夜。TBST洗3次，每次5 min。室溫孵育相應(yīng)種屬的二抗( 1∶10 000) 1 h，TBST洗3次，顯影。將顯影得到的條帶用Quantity One軟件進行半定量分析。

1．2．9免疫熒光染色將RAW264. 7細(xì)胞種于含蓋玻片的24孔板進行培養(yǎng)，長至40%左右進行SNX10小RNA干擾。干擾72 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌后加入免疫染色固定液室溫固定15 min，用PBS洗滌2次。然后用含1%Triton X100 的PBS洗室溫靜置透膜10 min。透膜結(jié)束后用PBS 洗3次，然后用含10%山羊血清的PBS洗室溫封閉30 min。室溫孵育p65一抗1 h，PBS洗3次，再用相應(yīng)種屬的二抗室溫避光孵育1 h，染核與封片，激光共聚焦顯微鏡拍照成像。

1．3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13. 0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1PCR鑒定小鼠基因型使用雜合型( + /－)小鼠進行繁殖的后代中，含3種基因型不同的小鼠，分別為野生型( + / + )，約占0. 25;雜合型( + / －)，約占0. 5;純合型(－/－)，約占0. 25。基本符合遺傳學(xué)規(guī)律( Fig 1)。

Fig 1 Identification of genotype of mice by PCR

2．2SNX10對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響吞噬識別是巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能的前提，由Fig 2可知，SNX10敲除小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞與野生組相比，吞噬能力并沒有明顯差異。說明敲除SNX10對巨噬細(xì)胞的吞噬功能并無明顯影響。

2．3SNX10對巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響進一步研究SNX10基因敲除后對巨噬細(xì)胞處理細(xì)菌能力的影響。由Fig 3可知，SNX10敲除后可明顯增強巨噬細(xì)胞的殺菌能力，差異具有顯著性( P＜0. 05，P ＜0. 01 vs野生型)。

Fig 2 Effect of SNX10 knockout on phagocytosis of bio-particles

2．4SNX10對小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12/ 23 p40、IL-6的影響巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中會分泌各種細(xì)胞因子，本實驗研究巨噬細(xì)胞炎癥化后分泌的幾種主要細(xì)胞因子。由Fig 4A中發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，可明顯升高TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6 mRNA的表達(dá)( P＜0. 01)。與WT組相比，SNX10敲除組TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)( P ＜0. 01)。由Fig 4B可知，ELISA檢測結(jié)果與q-PCR一致。結(jié)果表明，SNX10敲除后可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌促炎因子。

Fig 3 Effect of SNX10 knockout on sterilization ability of bone marrow derived macrophages

2．5SNX10對骨髓細(xì)胞NF-κB通路的影響NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)等病理過程中的重要調(diào)控途徑，調(diào)節(jié)某些炎癥因子如TNF-α、IL-6的活性，本實驗研究SNX10敲除后對巨噬細(xì)胞IκB蛋白水平的表達(dá)及p65入核情況。由Fig 5A可知，SNX10敲除后，骨髓巨噬細(xì)胞IκB表達(dá)上調(diào)，同時，F(xiàn)ig 5B表明，SNX10敲除后，p65入核減少。SNX10干擾后p65免疫熒光染色結(jié)果與Western blot結(jié)果一致( Fig 5C)。

3　討論

巨噬細(xì)胞是機體重要的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，可塑性是巨噬細(xì)胞的一個標(biāo)志性特點，可隨著環(huán)境的變化激活極化為不同的類型，按照其功能可分為兩種亞型，即M1型和M2型［7］。M1型參與促炎反應(yīng)，主要分泌一些促炎因子，如TNF-α、IL-6等，在宿主防御細(xì)菌和病毒感染發(fā)揮核心作用［8］。M2型巨噬細(xì)胞與抗炎反應(yīng)、寄生蟲感染等疾病密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞在機體正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和對病原體的免疫反應(yīng)中扮演著不同的角色，在組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［9－10］。因此，研究巨噬細(xì)胞的相關(guān)功能，對理解機體疾病的發(fā)生發(fā)展并提出治療方案具有重要意義。

Fig 4 Effect of SNX10 knockout on expression and production of TNF-α，IL-12/23 p40，IL-6 in bone marrow derived macrophages

Fig 5 Effect of SNX10 knockout on NF-κB signaling pathway

巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，廣泛參與機體的各種免疫反應(yīng)，而NF-κB是炎癥反應(yīng)中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，常以異源二聚體的形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到各種胞內(nèi)外刺激后，IκB激酶激活，IκB蛋白磷酸化，泛素化從而被降解。NF-κB信號途徑迅速激活，激活后的NF-κB進入核內(nèi)，與DNA模板上的特異性蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)特異性mRNA的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子。在炎癥反應(yīng)中，NF-κB參與上調(diào)早期炎癥因子TNF-α、IL-6等的基因轉(zhuǎn)錄。

分揀連接蛋白10( sorting nexin 10，SNX10)是含有PX結(jié)構(gòu)域的SNX家族成員，具有調(diào)節(jié)內(nèi)體分選的功能。SNX蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控真核細(xì)胞內(nèi)吞過程的家族，越來越多證據(jù)表明SNX家族不僅參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸、內(nèi)體分選，而且還與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架重建等密切相關(guān)。然而，關(guān)于SNX10的具體功能及其分子調(diào)控機制尚不完全清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，SNX10與惡性骨硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞等有著密切聯(lián)系［11－12］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNX10缺失能夠促進巨噬細(xì)胞清除病原菌的能力，并能抑制炎癥因子TNF-α、IL-12/23 p40、IL-6的表達(dá)，TNF-α、IL-6是參與早期炎癥反應(yīng)的炎癥因子，大量研究表明TNF-α、IL-6的表達(dá)與炎癥程度呈正相關(guān)，NF-κB信號通路是調(diào)控炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵途徑［13］，SNX10敲除后IκB蛋白表達(dá)明顯增多，p65入核減少，據(jù)此推測，SNX10很可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來影響巨噬細(xì)胞功能。綜上所述，SNX10敲除可增強巨噬細(xì)胞抗菌消炎的免疫功能，其作用機制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路有關(guān)，其具體調(diào)控機制還在深入研究之中。本研究的實施為闡明SNX10新功能提供了依據(jù)，也為巨噬細(xì)胞相關(guān)的多種免疫疾病的治療提供了新的潛在靶點。

(致謝:實驗工作是在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室完成的，謹(jǐn)致謝意。)

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Effects of Sorting nexin 10 deficiency on function of mouse macrophages

LI Wan-zhen1，YOU Yan1，PENG Jin1，ZHOU chun1，LI Dong1，SHEN Xiao-yan1，2
( 1．Laboratory of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China; 2．Dept of Pharmacology，School of Pharmacy and Institute of Biomedical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 201203，China)

Abstract:AimTo discuss the influence of endosome /lysosome transport proteins SNX10 on macrophage，providing new potential targets for the treatment of a variety of related immune diseases．MethodsThe genotype of mice was identified by PCR．The role of SNX10 in phagocytosis of bacterial components andbook=89,ebook=98sterilization by macrophages were assessed．The levels of TNF-α、IL-12/23 p40 and IL-6 were measured by q-PCR and ELISA assay．Finally，the NF-κB signaling pathway was evaluated by Western blot and immunofluorescence staining．ResultsEx vivo experiments showed that SNX10 knockout could enhance bactericidal ability and inhibit the expression and production of TNF-α，IL-12/23 p40 and IL-6 of macrophages． These effects might attribute to the inhibition of NF-κB signaling pathway activation．ConclusionSNX10 knockout could enhance bactericidal ability and inhibit the inflammatory response of macrophages，and its mechanism may be achieved through the NF-κB signaling pathway．

Key words:SNX10; macrophage; phagocytosis; sterilization; TNF-α; IL-12/23p40; IL-6; NF-κB

作者簡介:李婉貞( 1991－)，女，碩士生，研究方向:藥物藥理與毒理學(xué)，E-mail: lwz531lwz@163．com;

基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目( No 81573441，81371923) ;廣東省自然科學(xué)基金課題( No S2013010015313)

收稿日期:2015－09－10，修回日期: 2015－11－18

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0084－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．018