白藜蘆醇通過降低NF-κB p65乙酰化緩解大鼠神經病理性疼痛

王依慰，劉清珍，陳春龍，支亦博，章　潔，李偉彥

( 1．徐州醫學院江蘇省麻醉學重點實驗室，2．徐州醫學院江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室，江蘇徐州　221004;3．南京軍區南京總醫院麻醉科，江蘇南京　210002)

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白藜蘆醇通過降低NF-κB p65乙酰化緩解大鼠神經病理性疼痛

王依慰1，2，劉清珍3，陳春龍3，支亦博3，章潔1，2，李偉彥3

( 1．徐州醫學院江蘇省麻醉學重點實驗室，2．徐州醫學院江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室，江蘇徐州221004;3．南京軍區南京總醫院麻醉科，江蘇南京210002)

中國圖書分類號: R-332; R284．1; R322．81; R441．1; R745. 022; R977. 6

摘要:目的觀察白藜蘆醇對腰5脊神經結扎( L5spinal nerve ligation，SNL)大鼠的鎮痛作用及其相關機制。方法90只♂SD大鼠隨機分為6組( n =15)。正常組;假手術組;疼痛組;高、中和低劑量白藜蘆醇組。正常組不做處理，假手術組僅暴露腰5脊神經，其余各組行SNL。高、中、低劑量組分別將300、30、3 μg白藜蘆醇溶于10 μL的100%二甲基亞砜溶劑中，于SNL術后d 4經鞘內導管給藥，每天1次，連續給藥4 d。術后1、3、5、7、9、11、14 d測定各組大鼠熱縮足潛伏期( paw withdrawal latency，PWL)。行為學測試結束后處死大鼠，取腰段脊髓。Western blot檢測沉默信息調節因子1 ( silent information regulator 1，SIRT1)和乙酰化p65蛋白的表達水平，采用免疫熒光法測定脊髓背角活化的核因子κB ( NF-κB)表達。結果與假手術組比較，疼痛組大鼠術后PWL明顯降低( P＜0. 05)，SIRT1蛋白含量明顯減少( P＜0. 05)，乙酰化p65蛋白含量和活化的NF-κB表達明顯增多( P＜0. 05)。與疼痛組比較，高、中劑量組大鼠給藥后PWL 和SIRT1蛋白含量明顯升高( P＜0. 05)，乙酰化p65蛋白含量和活化的NF-κB表達明顯減少( P＜0. 05)。結論鞘內注射白藜蘆醇可緩解神經病理性疼痛，其機制可能與激活SIRT1，促進p65去乙酰化，從而抑制NF-κB活化有關。

關鍵詞:神經病理性疼痛;白藜蘆醇;沉默信息調節因子1; NF-κB; p65;乙酰化

李偉彥( 1965－)，男，博士，主任醫師，博士生導師，研究方向:麻醉與鎮痛的基礎與臨床，Tel: 025-80860147，E-______mail: weiyanlee@ sina．com

神經病理性疼痛( neuropathic pain，NeP)發展早期NF-κB被激活，NF-κB信號通路在脊髓中被活化，參與傷害性信息的傳遞和疼痛的產生［1］。p65 是NF-κB的一個亞單位，其翻譯后乙酰化修飾能夠精細地調控NF-κB的轉錄活動。沉默信息調節因子1( silent information regulator 1，SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶。研究表明，SIRT1能直接去乙酰化NF-κB的p65亞單位，降低其乙酰化水平，抑制NF-κB的激活［2］。白藜蘆醇屬于多酚化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等生物學活性，已有文獻報道白藜蘆醇是SIRT1的激動劑［3］。因此，我們推測白藜蘆醇可能通過激活SIRT1，促進p65去乙酰化，從而抑制NF-κB活化來發揮鎮痛作用。本研究觀察L5脊神經結扎( spinal nerve ligation，SNL)大鼠脊髓內SIRT1和p65蛋白乙酰化水平的變化，并探討SIRT1激活劑白藜蘆醇對神經病理性疼痛的作用和可能機制。

1　材料與方法

1．1實驗動物和分組清潔級成年♂SD大鼠，體質量180～220 g，由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供。實驗所實行操作均符合國際疼痛研究會的準則，并且經動物倫理委員會許可。將鞘內置管成功的大鼠按照隨機數表法分為6組( n = 15)，正常組( Naive組)、假手術組( Sham組)、疼痛對照組( SNL組)、高劑量白藜蘆醇治療組( High組)、中劑量白藜蘆醇治療組( Middle組)、低劑量白藜蘆醇治療組( Low組)。

1．2鞘內置管大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉50 μg·g－1。參考Milligan等［4］的方法，常規消毒后在大鼠腰5-6間隙縱行切開，依次分離筋膜和肌肉，顯露L5白色椎板，摘除部分棘突后用5號針尖破脊間膜。用鑷子將一段長為15 cm的PE-10導管(寧波市科技園區安來軟件科技有限公司，中國)經L5-L6向上置入2 cm，出現鼠尾側向甩動視為穿刺成功。導管外端經皮下隧道至頸項部引出皮膚后固定，熱熔封口。術后單籠飼養大鼠以防止導管脫落。置管成功3 d后，剔除運動功能異常的大鼠，經導管注入2%利多卡因15 μL，如注射后30 s內大鼠出現雙后肢麻痹現象說明鞘內置管成功。

1．3SNL模型采用Kim等［5］法制備SNL模型，即自大鼠背部L5棘突水平縱行切開皮膚，依次分離組織暴露右側L5橫突，剪去L5部分橫突，顯露L5脊神經后用5-0絲線結扎。用生理鹽水清洗傷口后，分層縫合傷口，消毒，繼續飼養。Naive組不做處理，Sham組僅暴露L5脊神經不結扎。

1．4給藥方案High、Middle、Low組分別將300、30、3 μg白藜蘆醇溶于10 μL的100%二甲基亞砜( DMSO)溶劑中，于SNL術后d 4經鞘內導管給藥，每天1次，連續給藥4 d。SNL組則在相同時間點經鞘內導管注射10 μL 100% DMSO。

1．5行為學測定SNL術后1、3、5、7、9、11、14 d，固定于上午8: 00～10: 00，采用熱痛測痛儀器( Model390，IITC Science. Inc，美國)，參照Hargreaves等［6］方法，對所有大鼠右足測定熱縮足潛伏期( paw withdrawal latency，PWL)。測試前使大鼠在25℃安靜環境中適應約30 min。測痛儀以5 mm光斑照射大鼠右側第一足趾下著力點，照射時間不超過20s，以免出現灼傷。測試期間及時清除大鼠排泄在玻璃板上的大小便，以免影響熱痛閾反應時間。每只大鼠均測量6次，每次間隔5min，去掉最大值和最小值，取4次測量值的平均值作為PWL。

1．6標本采集SNL術后d 7，各組大鼠完成疼痛行為學測試后隨機選擇3只大鼠，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉80 μg·g－1處死。用于Western blot檢測的標本用300～400 mL生理鹽水快速沖洗血液，之后取出脊髓的腰膨大段快速放入液氮中短暫保持。用于免疫熒光檢測的標本則再用400～500 mL 4%多聚甲醛先快后慢的灌注，取出脊髓的腰膨大段后，將其放入4%的多聚甲醛中后固定3 h，隨后轉入30%蔗糖中脫水2 d。

1．7Western blot將脊髓組織剪切成細小的碎片。取適量的RIPA裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L－1。按照每20mg組織加入150～250 mL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。蛋白定量后，加入SDS上樣緩沖液，沸水煮浴使其變性后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗:兔抗大鼠SIRT1( 1∶2000，Abcam，美國)或兔抗大鼠乙酰化NF-κB p65( 1∶1000，Pierce，美國)，4℃孵育過夜。復溫后，棄一抗，TBST清洗5min×6次，加HRP標記的羊抗兔二抗( 1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國)室溫孵育1 h，TBST清洗5min×6次，暗室內加顯色底物顯色曝光。定影內參為β-actin ( 1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國)。以目的條帶灰度值與βactin灰度值的比值反映SIRT1和乙酰化p65的表達水平。所得條帶經Adobe公司Photoshop軟件半定量分析處理。

1．8免疫組織熒光染色取多聚甲醛固定的L4～6腰膨大標本，經蔗糖溶液梯度脫水后用冰凍切片機進行連續切片，片厚20μm。5%的BSA封閉1h，隨后加入磷酸化p65單克隆抗體( 1∶200，Santa Cruz Biotechnology，美國)，4℃孵育過夜。用PBS清洗5min×3次后，加入異硫氰酸熒光素標記的二抗( 1 ∶300，Santa Cruz Biotechnology，美國)，室溫避光孵育2h，漂洗3次。每個標本隨機抽取5張切片，普通熒光顯微鏡下觀察。

1．9統計學分析采用SPSS 16. 0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示。大鼠行為學結果采用重復測量設計的方差分析，SIRT1、乙酰化p65蛋白表達采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結果

2．1大鼠PWL的變化6組大鼠術前PWL差異無統計學意義( P＞0. 05)。Sham組術側后肢PWL各時間點未見明顯改變( P＞0. 05)。SNL組大鼠與Sham組比較，PWL明顯降低( P＜0. 05) ; High、Middle組與SNL組比較，大鼠術后各時間點PWL增高( P＜0. 05)，但與Sham組相比仍存在統計學意義( P＜0. 05)，提示鞘內注射300、30 μg白藜蘆醇均可以減輕SNL大鼠的熱痛敏反應。SNL組和Low組術后各時間點PWL差異無統計學意義( P＞0. 05)，提示鞘內注射3 μg白藜蘆醇無鎮痛作用。見Fig 1。

Fig 1 Changes of PWL in all rats

2．2大鼠脊髓SIRT1蛋白和乙酰化p65的表達變化SNL術后d 7，與Sham組相比，SNL組脊髓腰膨大中的SIRT1蛋白含量明顯降低( P＜0. 05)。與SNL組相比，High、Middle組脊髓腰膨大中SIRT1含量明顯升高( P＜0. 05)，而Low組SIRT1蛋白含量無明顯變化( P＞0. 05)。見Fig2A。與Sham相比，SNL組脊髓腰膨大中的乙酰化p65的含量明顯升高( P＜0. 05)。與SNL相比，High、Middle組脊髓腰膨大中乙酰化p65含量明顯下降( P＜0. 05)，而Low組乙酰化p65蛋白量無明顯變化( P＞0. 05)。見Fig 2B。

2．3腰段脊髓背角活化NF-κB的表達變化免疫熒光染色結果顯示，Sham組大鼠腰段脊髓背角中活化的NF-κB表達量較少。與Sham組相比，SNL活化的NF-κB表達量明顯增加。與SNL相比，Low組表達無明顯變化，而High組活化的NF-κB表達量明顯降低，見Fig 3。

3　討論

乙酰化是一種重要的翻譯后修飾，可以調節目標蛋白質的功能活性，與多種生理和病理過程密切相關。用藥物干擾組蛋白乙酰化的過程可以影響疼痛的行為，相反地，病理性疼痛狀態可能影響相關的傷害感受器基因的組蛋白乙酰化狀態［7］。組蛋白乙酰轉移酶( histone acetyltransferases，HAT)以及組蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC)相互拮抗、共同維持蛋白質乙酰化水平的動態平衡。

Fig 2 Expression of SIRT1 and Ac-p65 in the lumbar spinal cord of rats at d7( n =5)

Yeung等［2］率先提出，SIRT1作為一種重要的HDAC，可以直接去乙酰化NF-κB的p65亞單位，降低其乙酰化水平。敲除SIRT1基因可導致NF-κB過度乙酰化［8］。這都提示SIRT1是催化NF-κB去乙酰化的關鍵酶。白藜蘆醇是去乙酰化酶SIRT1的激動劑，屬于多酚化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等生物學活性。同時白藜蘆醇還可穿透血腦屏障，對神經產生保護作用，對外周和中樞神經炎癥疾病有較好的防治作用［9］。有研究證實鞘內注射白藜蘆醇能通過上調SIRT1蛋白表達，進而發揮延遲或減輕神經病理性疼痛的作用［3］，但其具體機制還未見完整的報道。本研究探索了SIRT1激活劑白藜蘆醇對神經病理性疼痛的影響。由于SNL模型熱痛閾變化明顯，穩定性好，可靠性高，所以我們選擇SNL模型作為本次神經病理性疼痛的模型。外周給予白藜蘆醇難以通過血腦屏障，為了更好的研究中樞效應，本實驗選擇鞘內注射。

Fig 3　NF-κB expression in the spinal cord at d7( n =5) (×200)

行為學顯示SNL術后即產生了明顯的熱痛閾值降低現象，并且持續至術后14 d。實驗結果表明每天注射300 μg和30 μg白藜蘆醇可以緩解SNL大鼠神經病理性疼痛的熱痛敏癥狀，并且緩解效果以連續給藥后d 4為甚。所以我們選擇給藥后d 4來研究大鼠脊髓中蛋白的變化。而停止給藥后，白藜蘆醇的鎮痛作用呈逐漸減弱的趨勢。提示每天注射一定劑量的白藜蘆醇可以明顯減輕大鼠神經病理性痛，這種鎮痛作用隨著給藥時間的延長逐漸減弱。每天注射3 μg白藜蘆醇沒有明顯鎮痛作用。同時，實驗過程中各組大鼠均無明顯不良反應，說明鞘內注射白藜蘆醇是安全、可靠的。

NF-κB信號通路的異常激活與神經病理性疼痛的發生、發展密切相關［1］。我們發現疼痛組大鼠脊髓中NF-κB的表達明顯高于正常對照組，這與之前的研究相一致［10］。研究證實白藜蘆醇可以抑制NF-κB信號通路［11］。因此，我們推測白藜蘆醇通過抑制NF-κB信號通路活性，來達到緩解神經病理性疼痛的作用。本研究中，我們利用免疫熒光法來檢測磷酸化p65亞基的表達來代表大鼠脊髓背角中NF-κB的活化程度。白藜蘆醇干預4 d后，High組( 300 μg白藜蘆醇組)大鼠脊髓背角中活化的NF-κB表達減少，Low組( 3 μg白藜蘆醇組)大鼠脊髓NF-κB活化程度無明顯變化。免疫熒光的結果與各組大鼠PWL變化情況相一致，進一步確認了白藜蘆醇的鎮痛作用，并且表明其鎮痛作用至少有一部分是通過抑制NF-κB通路而實現。

NF-κB/p65亞單位上310位賴氨酸( lysine，Lys)的乙酰化修飾水平與NF-κB的活性有明顯的正相關性。p65去乙酰化過程中，發揮主要作用的HDAC是SIRT1［12］。因此，我們推測白藜蘆醇是否通過激活SIRT1的HDAC活性來影響p65乙酰化，達到對NF-κB的抑制作用。為此，我們進一步檢測了各組大鼠脊髓中乙酰化的p65和SIRT1的含量。結果顯示: SNL術后大鼠脊髓中乙酰化p65含量明顯升高，提示p65的過度乙酰化可能參與了神經病理性疼痛的發生發展。連續4 d鞘內注射300、30 μg白藜蘆醇后，模型大鼠脊髓內乙酰化p65水平明顯降低，同時也逆轉了SNL導致的痛覺高敏現象。同時我們發現SNL組大鼠脊髓腰膨大組織中SIRT1呈低表達狀態，這與之前研究結果一致［3］，300μg和30μg白藜蘆醇對SIRT1蛋白有明顯的激活作用，但不能使SIRT1升至正常水平。提示SIRT1激活劑白藜蘆醇逆轉了p65的過度乙酰化，影響NF-κB表達，這可能是白藜蘆醇鎮痛作用的機制之一。

綜上所述，結扎腰5脊神經可降低SIRT1水平，乙酰化p65蛋白表達增多，激活NF-κB通路，促進大鼠產生神經病理性疼痛。鞘內注射一定量的白藜蘆醇能通過上調SIRT1來抑制p65乙酰化，從而降低NF-κB的表達，發揮鎮痛作用。本研究在更深入闡明神經病理性痛的發病機制的同時，為治療神經病理性疼痛提供新的思路。

(致謝:本實驗在南京軍區南京總醫院比較醫學科麻醉科實驗室完成，在此衷心感謝我的導師李偉彥教授的耐心培養，實驗室劉清珍老師的細心指導，各位同學的合作和幫助! )

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Resveratrol facilitates neuropathic pain in rats model by decreasing acetylation of NF-κB p65

WANG Yi-wei1，2，LIU Qing-zhen3，CHEN Chun-long3，ZHI Yi-bo3，Zhang Jie1，2，LI Wei-yan3
( 1．Key Laboratory of Anesthesiology of Jiangsu Province，Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221004，China; 2．Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology of Jiangsu Province，Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221004，China; 3．Dept of Anesthesiology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Naning 210002，China)

Abstract:AimTo investigate the antagonistic effect of resveratrol on neuropathic pain and its underlying mechanism．Methods Neuropathic pain was induced by ligation of L5spinal nerve ( SNL) in rats．90 male Sprague-Dawley rats，fit with intrathecal catheters were divided randomly into six groups ( n = 15) : naive group; sham group; SNL group; high dosage of resveratrol group ( 300μg) ; middle dosage of resveratrol group ( 30μg) and low dosage of resveratrol group ( 3μg)．The naive group did not make any process．In sham group，the L5spinal nerve was only exposed without ligation．Other groups received SNL．Different dosages of resveratrol dissolved in 10μL 100% DMSO were administered by intrathecal injections once a day for 4 days，starting on day 4 after SNL．Paw withdrawal latency ( PWL) was measured on day 1，3，5，7，9，11，14 days after surgery separately．On day 7 after behavioral testing，the lumbar segments of the spinal cord were removed to measure the level of SIRT1 and acetylated-p65( Ac-p65) for western blot．The activation of NF-κB was determined through calculating the percentage of NF-κB-immunofluorescence positive staining cells in this study．ResultsCompared with sham groups，the SNL group showed an obvious decrease( P ＜0. 05) of PWL and SIRT1 after surgery，whereas Acp65 and actived NF-κB significantly increased ( P＜0. 05) in the spinal cord．Administration with high and middle dosages of resveratrol markedly attenuated( P＜0. 05) SNL-induced thermal hyperalgesia and downregulation of SIRT1 and blocked ( P＜0. 05) the SNL-induced up-regulation of Ac-p65 and actived NF-κB in the spinal cord．ConclusionIntrathecal resveratrol can inhibit the development of neuropathic pain and suppress the activation of NF-κB signaling in SNL rats ．The analgesic effect of resveratrol is implemented partly via increasing the level of SIRT1 and deacetylating p65．

Key words:neuropathic pain; resveratrol; silent information regulator 1; NF-kappa B; p65; acetylation

作者簡介:王依慰( 1990－)，女，碩士，研究方向:麻醉與鎮痛的基礎與臨床，E-mail: wywtiantian@ sina．com;

基金項目:全軍“十二五”面上資助項目( No CWS11J017) ;南京軍區醫藥衛生科研基金資助項目( No 14ZX15)

收稿日期:2015－09－03，修回日期: 2015－11－03

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0089－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．019