白介素-1β增加血腦腫瘤屏障通透性的作用機制

王　健，孫月明，秦麗娟

(華北理工大學基礎醫學院，河北唐山　063000)

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白介素-1β增加血腦腫瘤屏障通透性的作用機制

王健，孫月明，秦麗娟

(華北理工大學基礎醫學院，河北唐山063000)

中國圖書分類號: R322．81; R329．24; ; R392. 12; R977. 6

摘要:目的研究白介素-1β( interleukin-1β，IL-1β)對膠質瘤細胞內血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)、腦血管內皮細胞內質膜微囊結構蛋白caveolin-1表達和質膜微囊小凹的影響，初步探討IL-1β開放血腫瘤屏障的可能機制。方法利用Transwell制備體外血腫瘤屏障模型。Western blot法動態監測IL-1β對膠質瘤細胞內VEGF、腦血管內皮細胞內caveolin-1蛋白表達水平的影響。透射電鏡觀察腦血管內皮細胞內質膜微囊小凹的數量，熒光素鈉滲出實驗評估IL-1β對血腫瘤屏障通透性的影響。結果成功建立了體外血腫瘤屏障模型。當IL-1β作用于體外血腫瘤屏障模型后，VEGF蛋白的表達量增加，于60min時達到峰值，至120min時恢復到初始狀態。體外血腫瘤屏障通透性亦于IL-1β作用60min時最大。另外，我們的研究結果還發現，IL-1β作用于血腫瘤屏障模型60min時，腦微血管內皮細胞中質膜微囊結構蛋白caveolin-1的蛋白表達水平及質膜微囊小凹的數量達到峰值，其后減少，并于120min時恢復到未給藥狀態。結論IL-1β增加了血腫瘤屏障的通透性，此作用可能與IL-1β通過VEGF/caveolin-1途徑增加了質膜微囊小凹數量有關。

關鍵詞:血管內皮生長因子;白介素-1β;血腫瘤屏障; caveolin-1;膠質瘤;質膜微囊小凹

秦麗娟( 1975－)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向:腦腫瘤防治，通訊作者，E-mail: qinlj20012003@ 163．com。

神經膠質瘤簡稱膠質瘤，是起源于神經膠質細胞的一種惡性腦腫瘤。目前臨床上對神經膠質瘤的治療大多主張綜合治療，即臨床手術后配合放化療等，以此來延長患者的生存時間，遏制其復發［1－2］。在臨床膠質瘤的治療過程中，由于血腫瘤屏障的存在，化療藥物無法直接進入病灶，即使有少量進入，也會因瘤組織內化療藥物的有效濃度過低而達不到理想的治療效果。因此，如何使抗腫瘤藥物通過血腫瘤屏障進入腫瘤組織，是目前臨床膠質瘤治療亟待解決的問題之一［3］。

1　材料與方法

1．1主要試劑與儀器羊抗大鼠caveolin-1多克隆抗體(英國Abcam公司)，羊抗大鼠VEGF多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，C6細胞株和培養基(中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心)，電泳儀( DYY-TB，北京六一儀器廠)，半干式碳板轉移電泳槽( DYY-Ⅲ40C，北京六一儀器廠)，凝膠成像分析系統( Bio-Rad，美國)，生物分子成像儀( Bio-Rad，美國)。

1．2C6細胞培養用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養C6膠質瘤細胞，37℃孵箱內孵育，并通以5%CO2。

1．3原代腦微血管內皮細胞的培養采用出生2 ～3 d的Wistar大鼠4只，75%酒精中浸泡1 min后斷頭取腦，分離鼠腦，置于預冷的D-Hank’s液中，剔除大血管和腦膜，將皮質剪成1mm3的小塊，玻璃勻漿器勻漿后加入15%葡聚糖10 mL，10 000×g離心15 min后棄上清，保留底部“血管段”加入4 mL DMEM(含20% FBS)及1 mLⅡ型膠原酶( 5 g· L－1)，37℃水浴震蕩孵育10 min，1000 r·min－1離心5min后棄上清，加入較大量DMEM培養液輕柔吹打均勻，接種于已涂布基質的35 mm一次性培養皿中，同時加入( 150～200) mg·L－1的ECGS，置于控溫在37℃并通以5%的CO2的培養箱內靜置培養，待細胞生長較密集后進行傳代培養。

1．4體外血腫瘤屏障模型的制備首先將2．0× 108個·L－1密度的C6膠質瘤細胞接種于Transwell小室的下層，并加入適量的培養基。2 h后翻轉小室，加入新鮮培養基。當細胞融合至80%時，將大鼠腦微血管內皮細胞接種至Transwell小室的上室(約1．2×105個細胞)，繼續共培養4～7d后融合。此后，每2 d更換1次培養基。

1．5體外血腫瘤屏障模型跨膜電阻( TEER)值測定采用Millicell ERS伏特歐姆計檢測體外血腫瘤屏障模型的電阻。測量時將Millicell ERS伏特歐姆計模式置于歐姆檔，打開電源，將STX01電極插入Transwell，長電極在外部，短電極在內部，電極與培養皿垂直。細胞跨膜電阻值計算公式: TEER = (ΔΩ測定值－ΔΩ空白值)×ΔA。ΔΩ測定值為Transwell小室的上、下室之間電阻值，ΔΩ空白值為未培養細胞但是具有相同體積培養液的空白Transwell小室的上、下室間電阻值，ΔA為Transwell小室的上、下室之間膜的面積。

1．6熒光素鈉滲出實驗測定血腫瘤屏障的通透性

測定前用無血清的DMEM培養液換液，加入100 mg·L－1熒光素鈉和0. 5 μg·L－1的IL-1β于Transwell下室，于不同時間點( 10、30、60、90和120 min)從Transwell下室內取100μL培養液，用熒光分光光度計檢測通過血腫瘤屏障模型的熒光素鈉量，用熒光強度間接反映血腫瘤屏障通透性。

1．7Western blot法動態檢測膠質瘤細胞內VEGF、血管內皮細胞內caveolin-1的蛋白表達水平

體外血腫瘤屏障模型下室給予IL-1β( 0. 5 μg· L－1)后，收集不同時間點的C6膠質瘤細胞和腦微血管內皮細胞，采用Western blot法檢測膠質瘤細胞內的VEGF和腦血管內皮細胞內的caveolin-1的蛋白表達水平。PVDF膜置于WB爆光系統中曝光成像。對照組用PBS代替一抗。結果以蛋白表達強度表示，并通過分析各條帶IDV值來分析各組蛋白表達的變化。

1．8透射電鏡觀察質膜微囊小凹數量變化收集對照組和IL-1β作用60min時的腦微血管內皮細胞，用預冷的戊二醛固定，按透射電鏡要求制片，常規鉛鈾雙染色，電鏡下觀察細胞超微結構改變。

1．9統計學處理采用SPSS 11．5軟件進行統計學處理。跨膜電阻值、VEGF和caveolin-1的表達水平均以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2　結果

2．1跨膜電阻值變化評估體外血腫瘤屏障模型是否成功建立體外血腫瘤屏障模型成功建立的標準是電阻值達到201Ω·cm2。本實驗研究發現，體外屏障模型的TEER值從3 d開始增加，于8 d后趨于平穩，至11 d達到了201Ω·cm2，即成功制備了體外血腫瘤屏障模型( Tab 1)。

2．2血腫瘤屏障的通透性變化IL-1β作用于血腫瘤屏障模型后，熒光素鈉滲出量增加，60 min時達最大值( Fig 1)。

Fig 1 Leakage of sodium fluorescein( n =15)

2．3IL-1β對膠質瘤細胞內VEGF表達的影響

IL-1β作用于體外血腫瘤屏障模型后，C6細胞內VEGF的表達開始增加，至IL-1β作用60min時表達量最多，其后減少( Fig 2)。

Fig 2 Effect of IL-1β on expression of VEGF in glioma cells( n =15)

Tab 1 TEER changes of blood tumor barrier model in vitro(±s，Ω·cm2，n =10)

Tab 1 TEER changes of blood tumor barrier model in vitro(±s，Ω·cm2，n =10)

Time/d 1_______ _____2_______ ______________________________________________________________________________________ ______3_4_5_6_7_8_9_10_11_12 TEER _(Ω·cm2)____________________________________________________________________________________________________________ _114±5　127±6　135±8　143±6　158±3　165±6　174±7　185±5　192±6　198±3　201±4　199±8

Fig 3 Effect of IL-1β on expression of caveolin-1 in brain microvascular endothelial cells( n =15)

2．5透射電鏡觀察質膜微囊小凹數量變化經IL-1β處理60min的腦微血管內皮細胞，其質膜微囊小凹數量較對照組明顯增多( Fig 4)。

Fig 4 Changes of number of plasma membrane vesicles(×12 000)

3　討論

IL是由多種細胞產生并作用于白細胞或免疫細胞之間的一種細胞因子。它的主要作用是激活與調節免疫細胞，引起炎癥介質釋放，活化T細胞，刺激B細胞的增殖與分化，并在炎癥反應中起到致熱源作用［4］。IL-1是一種分子多肽，有IL-1a及IL-1β兩種亞型，分子質量皆為17. 5 ku。IL-1a由159個氨基酸組成，IL-1β含153個氨基酸。雖然兩者是由不同的基因分別編碼而成，但IL-1α和IL-1β具有同樣的親和力，都可以與相同的細胞表面受體相結合，發揮相同的生物學作用。

有研究證實: IL-1β可以引起動物可逆性的血腫瘤屏障損傷，在IL-1β過表達時，還可引起中性粒細胞浸潤和中性粒細胞依賴性的血腫瘤屏障通透性增加。在本實驗中，我們檢測了IL-1β作用于血腫瘤屏障后熒光素鈉滲出情況變化，發現IL-1β能夠增加體外血腫瘤屏障模型的通透性，于60 min時變化最為明顯。我們前期的實驗研究結果也表明IL-1β與血腫瘤屏障的通透性增加有關，但其具體的分子作用機制尚不十分清楚［5］。

有研究發現，IL-1β的主要作用部位是血管內皮細胞［6－7］。而VEGF在血管內細胞的增殖、遷移和體內血管的形成過程中發揮著非常重要的作用［8－12］。我們的實驗研究結果顯示，IL-1β可以引起膠質瘤細胞內VEGF的表達增多，且于IL-1β作用于血腫瘤屏障模型60min時達高峰，其后減少，此變化趨勢與IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的時態變化相一致，因此我們推測，VEGF可能介導了IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的過程。

血腫瘤屏障通透性的增加主要通過兩條途徑來實現，即跨細胞途徑和細胞旁途徑。本實驗主要從跨細胞途徑即吞飲小泡的形成方面來研究VEGF對IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的影響。Caveola與標記蛋白caveolins一起合稱為Caveolae，廣泛存在于不同類型的細胞中。Caveolae最初在透射電鏡中顯示為“小孔”，而Yamada在1955年首次用細胞內caveolae來描述膀胱內皮細胞內發現的50～100nm胞質膜的內陷［13］。幾年后Palade也在血管內皮細胞中發現了這種結構，并稱為胞質小囊泡［14］。Caveolae是質膜上形成囊狀內陷結構的主要因素［15］，是caveolae發揮跨細胞內吞作用的關鍵因子［16］。為此，本研究采用免疫蛋白印跡法檢測了IL-1β作用于腦血管內皮細胞后caveolin-1蛋白表達的變化，發現IL-1β能夠上調質膜微囊標志蛋白caveolin-1的表達水平和質膜微囊小泡的數量，且于IL-1β作用后60min時最多，這與IL-1β引起的VEGF表達變化和血腫瘤屏障通透性變化的時相相一致，提示IL-1β可能是通過膠質瘤細胞釋放VEGF，VEGF再作用于鄰近的腦微血管內皮細胞來上調質膜微囊標志蛋白caveolin-1的表達水平，進而增加質膜微囊小凹的數量，從而增加了血腫瘤屏障的通透性。

在VEGF影響IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的過程中，可能還有其他因子或信號通路參與其中，這是我們今后需要進一步探討的問題。

米九也曾給他出過主意：應該把營業部的所有人帶到寺廟里去，對著釋迦牟尼佛賭咒發誓沒有偷盜。當時他也不是沒想過，可營業部里好幾個都是漢族，而且自己雖然娶了個藏族老婆，可對賭咒發誓的事也不大相信。他后來還跟登子提過此事，登子也和他一個觀點，覺得誰也不會在佛主前承認自己偷了東西。

(致謝:本研究是在華北理工大學基礎醫學實驗中心完成，感謝實驗中心為本研究提供實驗平臺和技術支持，感謝實驗中心所有老師的指導。)

參考文獻

［1］Harford-Wright E，Lewis K M，Vink R．Towards drug discovery for braintumours: interaction of kinins and tumours at the blood brain barrier interface［J］．Recent Pat CNS Drug Discov，2011，6( 1) : 31 －40．

［2］Thompson E M，Frenkel E P，Neuwelt E A．The paradoxical effect of bevacizumab in the therapy of malignant gliomas［J］．Neurology，2011，76( 1) : 87－93．

［3］秦麗娟，谷艷婷，王艷蕾，等．白介素-1β增加血腦腫瘤屏障通透性的作用機制［J］．中國藥理學通報，2013，29( 9) : 1248－51．

［3］Qin L J，Gu Y T，Wang Y L，et al．Adenosine receptor mediated effect and mechanism of tumor necrosis factor-α opening bloodtumor barrier［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29( 9) : 1248－51．

［4］Isanejad A，Saraf Z H，Mahdavi M，et al．The effect of endurance training and downhill running on the expression of IL-1β，IL-6，and TNF-α and HSP72 in rat skeletal muscle．Cytokine［J］．Cytokine，2015，73( 2) : 302－8．

［5］秦麗娟，薛一雪，谷艷婷，等．白介素-1β在緩激肽開放血腦屏障過程中的作用及其機制［J］．中國藥理學通報，2012，28( 1) : 58－61．

［5］Qin L J，Xue Y X，Gu Y T，et al．Effect and mechanisms of interleukin -1β in process of opening the blood -brain barrier by bradykinin［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28( 1) : 58－61．

［6］Allan S M，Rothwell N J．Cytokines and acute neurodegeneration ［J］．Nat Rev Neurosci，2001，2( 10) : 734－44．

［7］Yamada E．The fine structure of the gall bladder epithelium of the mouse［J］．J Biophys Biochem Cytol，1955，1( 5) : 445－58．

［8］Davies D C．Blood-brain barrier breakdown in septic encephalopathy and brain tumors［J］．J Anat，2002，200( 6) : 639－46．

［9］Faehling M，Kroll J，F?hrk J，et al．Essential role of calcium in vascular endothelial growth factor A-induced signaling: mechanism of the antiangiogenic effect of carboxyamidotriazole［J］．FASEB J，2002，16( 13) : 1805－7．

［10］Argaw A T，Asp L，Zhang J，et al．Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease ［J］．Clin Invest，2012，122( 7) : 2454－68．

［11］Wei M，Li H，Huang H，et al．Increased expression of EMMPRIN and VEGF in the rat brain after gamma irradiation［J］．J Korean Med Sci，2012，27( 3) : 291－9．

［12］Kim J，Jung Y．Different expressions of AQP1，AQP4，eNOS and VEGF proteins in ischemic versus non-ischemic cerebropathy in rats: potential roles of AQP1 and eNOS in hydrocephalic and vasogenic edema formation［J］．Anat Cell Biol，2011，44( 4) : 295－303．

［13］Cox D J，Pilkington G J，Lantos P L．The fine structure of blood vessels in ethylnitro sourea-induced tumours of the rat nervous system: with special reference to the breakdown of the blood-brain barrier［J］．Exp Pathol，1976，57( 4) : 419－30．

［14］Vaidyanathan R，Vega A L，Song C，et al．The interaction of caveolin 3 protein with the potassium inward rectifier channel Kir2．1: physiology and pathology related to long qt syndrome 9 ( LQT9) ［J］．J Biol Chem，2013，288( 24) : 17472－80．

［15］Ariotti N，Parton R G．SnapShot: caveolae，caveolins，and cavins ［J］．Cell，2013，154( 3) : 704．

［16］Karamysheva A F．Mechanisms of angiogenesis［J］．Biochemistry，2008，73( 7) : 751－62．

Mechanism of IL-1β enhance Blood-Brain Tumor Barrier permeability

WANG Jian，SUN Yue-ming，QIN Li-juan
( School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，China)

Abstract:AimTo study the effect of IL-1β on protein expression of vascular endothelial growth factor in glioma cells and plasma membrane microcapsule structure protein caveolin-1 and plasma membrane vesicles in brain microvascular endothelial cells，and preliminarity discuss the possible mechanism of IL-1β opening blood tumor barrier．Methods The tumor barrier model was established by transwell in vitro．The effect of IL-1β on the expression of VEGF in glioma cells and caveolin-1 in brain microvascular endothelial cells was dynamically monitored by Western blot．TEM was used to observe the number of plasma membrane vesicles of brain microvascular endothelial cells．Sodium fluorescein leakage test was used to assess the permeability of blood tumor barrier after IL-1β．ResultsThe tumor barrier model was successfully established by transwell in vitro．When IL-1β treated the model of blood tumor barrier，the expression of VEGF increased，and reached the peak at 60min，and recovered to the initial state at 120min．The permeability of the blood tumor barrier model was the highest at 60min．In addition，our results also found that，the protein expression of plasma membrane microcapsule structure protein caveolin-1 and number of plasma membrane vesicles in brain microcapsule endothelial cells reached peak at 60 min，subsequently reduced and returned to non drug state at 120min．ConclusionIL-1β increases blood tumor barrier permeability，which may be related to IL-1β increasing the number of plasma membrane vesicles through VEGF/caveolin-1 pathway．

Key words:VEGF; IL-1β; blood tumor barrier; caveolin-1; glioma; plasma membrane vesicles

作者簡介:王健( 1989－)，男，碩士，研究方向:腦腫瘤防治;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 81101912) ;河北省中醫藥管理局中醫藥類科研項目( No 2014195) ;河北省衛生廳科學研究基金項目( No 20150491) ;河北省科技計劃項目( No 152777189)

收稿日期:2015－09－25，修回日期: 2015－11－25

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0094－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．020