HPLC測定大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸及其藥代動力學研究

彭兆亮，李　潔，樊　玲，王雪琦，黃　鵬，栗進才，汪電雷，，陳亞軍，王淑君，汪珊珊，張　悅

( 1．安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥　230031;2．亳州職業技術學院，安徽亳州　236800)

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HPLC測定大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸及其藥代動力學研究

彭兆亮1，李潔1，樊玲1，王雪琦1，黃鵬1，栗進才2，汪電雷1，2，陳亞軍1，王淑君1，汪珊珊1，張悅1

( 1．安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥230031;2．亳州職業技術學院，安徽亳州236800)

中國圖書分類號: R-332; R284. 1; R446. 11; R969. 1

摘要:目的建立測定大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸濃度的HPLC方法，并對大鼠尾靜脈注射給藥1，8-二川芎嗪基大黃酸后，研究其在大鼠體內的藥代動力學。方法采用大黃素為內標，血漿樣品用甲醇沉淀蛋白后進行HPLC分析，流動相為甲醇－0. 1%甲酸水( 78∶22，V/V)，流速為1. 0 mL·min－1，檢測波長為275 nm。大鼠單劑量靜脈注射2、4、8 mg·kg－11，8-二川芎嗪基大黃酸后，測定給藥后不同時間點大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸的濃度，并對其血藥濃度－時間曲線采用DAS 2. 1軟件擬合，計算藥動學參數。結果1，8-二川芎嗪基大黃酸在0. 05－10. 00 mg·L－1血漿濃度范圍內線性關系良好( r = 0. 996 2)，定量下限為0. 05 mg·L－1，提取回收率均大于88%，日內和日間差異RSD均小于6%，方法學考察均符合要求。1，8－二川芎嗪基大黃酸按2、4和8 mg·kg－1靜脈注射給藥后，在大鼠體內的T1/2分別為( 68. 35±1. 36)、( 69. 32±2. 21)、( 69. 32±2. 03) min，AUC0－t分別為( 101. 03±24. 9)，( 144. 79±3. 29)，( 231. 92±19. 30) min·mg·L－1。結論本實驗所建立的HPLC方法操作簡便、快速、專屬性強，可用于1，8-二川芎嗪基大黃酸血藥濃度分析及其藥代動力學研究。

關鍵詞:1，8-二川芎嗪基大黃酸; HPLC;大鼠;藥代動力學;血藥濃度;靜脈注射

栗進才( 1981－)，男，碩士，講師，研究方向:中藥化學，通訊作者，Tel: 0558-5587006，E-mail: ahbanli@163．com;

汪電雷( 1977－)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向:藥物代謝動力學，通訊作者，Tel: 0551-68129153，E-mail: dlwang@ ahtcm．edu．cn

大黃酸屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，含有2個羥基和1個羧基，是蓼科植物大黃、何首烏、虎杖等多種中藥的主要有效成分［1］。具有廣泛的藥理活性，例如抗腫瘤、抗炎、抗菌、調節腎功能等作用［2］。研究表明，大黃酸能抑制內毒素誘生的大鼠巨噬細胞IL-12mRNA過度表達，能使［Ca2 +］濃度降低［3］。另有報道，大黃酸對小鼠腹腔巨噬細胞內白三烯C4、B8( LTC4、LTB4)的生物合成有較強的抑制作用，其IC50分別為0. 44、2. 78 μmol·L－1，并能提高巨噬細胞內環磷腺苷( cAMP)水平，抑制其花生四烯酸代謝［4］，以上研究說明大黃酸對炎癥的預防和治療具有明顯的效果，且目前臨床上已經使用的大黃酸1，8-二乙酰化物可治療骨關節炎［5］。川芎嗪( tetramethylpyrazine，TMP，Fig 1A)是從傘形科藁本屬植物川芎的根中提取的生物堿，是川芎的有效成分之一，具有廣泛的藥理作用，例如改善心、腦血管系統微循環，鎮靜鎮痛，抗腫瘤等［6］。且川芎嗪具有很好的生物活性，易于透過血腦屏障。本課題通過藥物化學拼合原理，將大黃酸和川芎嗪以醚鍵結合，將兩個具有活性的化合物結合在一起，修飾成大黃酸醚類衍生物1，8-雙( 3，5，6-三甲基吡嗪基-2-甲氧基) -9，10-二氧代-9，10二氫蒽-3-羧酸(簡稱1，8-二川芎嗪基大黃酸，Fig 1B)以期開發具有更好活性的大黃酸類藥物。前期研究表明該化合物比大黃酸酯類化合物更具有明顯的藥理活性，且可用于治療或預防與T-細胞增殖有關或由促炎細胞因子介導的疾病，具有抗炎、抗腫瘤等作用［7］。本文旨在采用HPLC建立大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸的測定方法，考察其在大鼠體內的藥代動力學，以期為進一步的開發和研究提供必要的參考。

Fig 1 Chemical structure of TMP ( A) and 1，8 TMP Rhein ( B)

1　材料

1．1儀器島津高效液相色譜儀:包括LC-10AT泵、CBM-10Alite控制器、SPD-10Avp紫外檢測器、CTO-10ASvp柱溫箱、LC-Solution工作站; Milli-Q Gradient A10超純水器( Millipore Inc．USA) ; XW-80A微型漩渦混合器(上海醫大儀器廠) ; Centrifuge 5804R臺式高速離心機(上海東兢電子有限公司) ; BP211D型電子天平(德國Sartorius公司) ; JL-180超聲儀(上海吉理超聲儀器有限公司)。

1．2動物SPF級SD大鼠，♀♂兼用，體質量200 ～250 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(皖) 2005－001。實驗前禁食12 h，可自由飲水。

1．3藥品與試劑1，8-二川芎嗪基大黃酸(安徽中醫藥大學黃鵬副教授課題組合成，純度95. 64%，經IR、MS、1H NMR結構確認，20140905)，色譜甲醇(上海星可高純溶劑有限公司) ;水為雙蒸水;其它試劑均為分析純。

2　HPLC測定法的建立與考證

2．1色譜條件色譜柱: Shimadzu VP-ODS ( 150 mm×4. 6 mm，5 μm) ;流動相:甲醇－0. 1%甲酸水( 78∶22，V/V) ;流速: 1. 0 mL·min－1;紫外檢測波長: 275 nm;柱溫25℃;進樣量: 20 μL;靈敏度: 0. 001 AUFS。

2．2標準溶液的配制1，8-二川芎嗪基大黃酸標準品的配制:精密稱取1，8-二川芎嗪基大黃酸標準品5. 00 mg至50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成0. 1 g·L－1貯備液，臨用前用甲醇稀釋成濃度0. 5、1、2. 5、5、10、25、50、100 mg·L－1的標準溶液。精密稱取大黃素2. 50 mg至50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，臨用前甲醇稀釋至25 mg·L－1作內標溶液，備用。

2．3血漿樣品處理取200 μL血漿，加內標溶液20 μL( 2. 5 mg·L－1)混勻后，加入2 mL甲醇，渦旋振蕩5 min，3 000 r·min－1離心10 min;取上清溶液1. 6 mL，在40℃水浴中用氮氣吹干，用200 μL甲醇溶解殘渣，再12 000 r·min－1離心10 min，取上清液適量，進樣20 μL，用樣品與內標峰面積比進行定量分析。

2．4專屬性考察按“2. 1”項下操作，分別考察空白血漿( 6個空白個體)、空白血漿中加入1，8-二川芎嗪基大黃酸(濃度為1. 0 mg·L－1)、單劑量靜脈注射給藥4 mg·kg－11，8-二川芎嗪基大黃酸30 min后大鼠血漿樣品。按“2. 3”項下操作，進行分析得到各樣色譜圖。

2．5標準曲線的制備及定量下限分別取空白血漿200 μL，加入1，8-二川芎嗪基大黃酸系列標準溶液，配制成相當于1，8-二川芎嗪基大黃酸濃度為0. 05、0. 1、0. 25、0. 5、1、2. 5、5、10 mg·L－1的血漿樣品，每組濃度平行做3份，按“2. 3”項下操作，以待測物濃度( C)為橫坐標，利用待測物與內標物的峰面積比值Ri為縱坐標進行線性回歸。按照色譜峰信噪比( S/N)為5確定定量下限，按照信噪比( S/ N)為3確定檢測下限。

2．6方法的精密度與準確度取大鼠空白血漿200 μL，加入不同濃度的1，8-二川芎嗪基大黃酸標準溶液，配制成低、中、高(分別為0. 1、1、5 mg· L－1) 3個濃度的血漿樣品，每個濃度平行做5份( n =5)，按“2. 3”項下操作，取20 μL進樣，用樣品與內標峰面積比Ri代入同一條工作曲線，計算得到相應的濃度，考察批內和批間的變異情況，再與加入濃度對照計算其準確度。

2．7提取回收率考察分別取空白血漿200 μL，加入1，8-二川芎嗪基大黃酸系列標準溶液，配制成低、中、高(分別為0. 1、1、5 mg·L－1) 3個濃度的血漿樣品，每個濃度平行做5份，按“2. 3”項下處理，取20 μL進樣，分析得到1，8-二川芎嗪基大黃酸峰面積As( H)。另取不同濃度的1，8-二川芎嗪基大黃酸標準溶液，用甲醇稀釋到低、中、高(分別為0. 1、1、5 mg·L－1) 3個濃度的樣品，每個濃度平行做5份( n =5)，進樣分析得到1，8-二川芎嗪基大黃酸峰面積As( D)。按照回收率= As( H) /As( D)平均值×100%，計算1，8-二川芎嗪基大黃酸的提取回收率。

2．8穩定性實驗分別取空白血漿200 μL，加入1，8-二川芎嗪基大黃酸系列標準溶液，配制成低、中、高(分別為0. 1、1、5 mg·L－1) 3個濃度的血漿樣品，每個濃度平行做5份( n = 5)，分別考察室溫放置6 h、樣品處置后放置12 h、反復凍融3次、長期放置－20℃冰箱凍存2周的穩定性。

2．9動物實驗取SPF級SD大鼠15只，♀♂兼用，體質量200～250 g，實驗前禁食12 h以上，可自由飲水，隨機分為3組，1，8－二川芎嗪基大黃酸經雙蒸水溶解后，按2、4、8 mg·kg－1的劑量經大鼠尾靜脈注射給藥( 0. 2 mL/100 g)，與給藥前( 0 min)和給藥后2、5、10、20、30、60、90、120、180、240、300 min，眼底靜脈叢連續取血0. 3 mL于經肝素處理的試管中，于3 000 r·min－1離心10 min，分離出血漿，按“2. 3”項下處理，進樣分析。

3　結果

3．1專屬性考察從Fig 2中可以看出，1，8-二川芎嗪基大黃酸的保留時間為6. 08 min，大黃素的保留時間為10. 83 min。結果表明在選定的色譜條件下，血漿中的內源性物質不干擾1，8-二川芎嗪基大黃酸的測定。

3．2標準曲線的制備及定量下限以1/X2i( Xi= Ci)作權重因子1，8-二川芎嗪基大黃酸最小二乘法血漿標準曲線為Y = 0. 109 3X + 0. 000 2( r = 0. 996 2)，線性范圍0. 05～10 mg·L－1，定量下限0．05 mg ·L－1( n = 5; RSD = 5. 65%，準確度96. 63%)最低檢測限0. 01 mg·L－1。

3．3提取回收率考察按“2. 7”項下操作，1，8-二川芎嗪基大黃酸低、中、高(分別為0. 1、1、5 mg·L－1) 3個濃度樣品的回收率分別為( 90. 39±0. 64) %、 ( 89. 80±2. 21) %、( 88. 66±2. 06) %。RSD分別為0. 71%、2. 46%、2. 32%。回收率均大于88%，且在待測濃度范圍內，樣品低、中、高濃度回收率穩定( RSD ＜10 %)，符合生物樣品分析要求。

Fig 2 HPLC chromatograms of A) Blank plasma; B) Blank plasma spiked with 1 mg·L－11，8-TMP rhein and 2．5 mg·L－1internal standard emodin; C) Rat plasma ( 30 min) after a single i．v．administration of 4 mg·kg－11，8-TMP rhein spiked with 2．5 mg·L－1internal standard emodin; 1: 1，8-TMP rhein; 2: Emodin

3．4精確度與準確度考察按“2. 6”項下操作，制備1，8-二川芎嗪基大黃酸低、中、高(分別為0．1、1、5 mg·L－1) 3個濃度樣品，每個濃度平行做5份( n =5)，連續測定3 d。根據隨行標準曲線求得實測濃度。實測濃度的RSD即為精密度，實測濃度和加入濃度的比值即為準確度。結果表明，1，8-二川芎嗪基大黃酸日內、日間準確度分別為94. 40%～99. 76%( RSD≤5. 7%，n = 5)和94. 32%～98. 65% ( RSD≤5. 4%，n =5)。所有樣品的日內和日間RSD均小于10 %，同時低、中、高3種濃度的準確度在85%～115%之間，符合生物樣品分析要求。

3．5穩定性考察按“2. 8”項下操作，結果表明在上述情況下樣品穩定性良好，具體見Tab 1。

Tab 1 Results of 1，8-TMP rhein room temperature，long-term placement，reduplicate freeze thawing，place after treatment in rat plasma(±s，n =5)

Tab 1 Results of 1，8-TMP rhein room temperature，long-term placement，reduplicate freeze thawing，place after treatment in rat plasma(±s，n =5)

Stability　0．1 mg·L－1　1．0 mg·L－1　5．0 mg·L －1 Roon temperature　0．094±0．005　0．98±0．081　4．99±0．43 Long-term placement　0．098±0．008　0．99±0．045　4．97±0．54 Reduplicate freeze thawing　0．096±0．006　0．93±0．094　5．03±0．35 Post-preparation____________ _______0．0_______________________ 99±0．009__0．95±0．078__4．89±0．63___

3．6血藥濃度－時間曲線與藥代動力學參數大鼠單劑量靜脈注射1，8-二川芎嗪基大黃酸所得的平均血藥濃度－時間曲線如Fig 4。將所得的血藥濃度－時間數據，采用DAS 2．1軟件擬合求算藥代動力學參數。其主要藥代動力學參數見Tab 2。2、4、8 mg·kg－1單劑量給藥后血藥濃度－時間曲線下面積AUC0－t與劑量相關性見Fig 3。

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of 1，8-TMP rhein after i．v．in rats (±s，n =5)

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of 1，8-TMP rhein after i．v．in rats (±s，n =5)

Parameter_______________ __________2 mg·kg－1　4 mg·kg－1　8 mg·kg－1___T1/2/min 68．35±1．36　69．32±2．21　69．32±2．03 CL/L·kg－1·min－1　0．034±0．013　0．024±0．007　0．030±0．002 V /L·kg－1　3．36±1．16　2．40±0．072　2．95±0．26 MRT0－t/min　91．03±12．45　83．95±6．80　85．08±4．19 AUC0－t/min·mg·L－1　101．03±24．9　144．79±3．29　231．92±19．30 AUC0－∞/min·mg·L－1____131．92±52．76______ 171．47±12．16______ 28___________ 4．87±19．97

Fig 3 Dose positive correlation of single dose ( 2，4，8 mg·kg－1) AUC0－t

Fig 4 Mean concentration-time curve of fifiteen rats after single dose i．v．adminisration of( 2，4，8 mg·kg－1) 1，8-TMP rhein( (±s，n =5)

4　討論

HPLC測定大鼠血漿中1，8-二川芎嗪基大黃酸的濃度，具有靈敏度高、分離度好等特點，尤其適用于大批量生物樣品測定。根據大鼠藥效劑量制定大鼠藥代研究給藥劑量，其高劑量最好接近最大耐受劑量，中、小劑量根據動物有效劑量的上下限范圍選取。本課題參考大黃酸在大鼠和比格犬體內的吸收動力學研究文獻中的給藥劑量［8］及1，8-二川芎嗪基大黃酸HPLC測定方法的定量下限，綜合考慮選擇2、4、8 mg·kg－1的給藥劑量。

本實驗對于流動相的選擇，分別考察了甲醇－水、甲醇－0. 1%甲酸水、甲醇－0. 05%甲酸水、甲醇－0. 01%甲酸水。發現用甲醇和不同濃度的甲酸水作為流動相時，1，8－二川芎嗪基大黃酸的峰型出現不同程度的拖尾現象。相比使用甲醇－0. 1%甲酸水作為流動相時拖尾現象減輕，且峰型較好。經過改變流動相比例，最終選擇甲醇－0. 1%甲酸水( 78 ∶22，V/V)時，出峰效果最好。

本實驗對比了大黃素、大黃酸和蘆薈大黃素3種內標物質。紫外全波長掃描發現大黃酸的最大紫外吸收波長為230、254 nm，蘆薈大黃素的最大紫外吸收波長為255、376 nm，大黃素的最大吸收波長為225、285、435 nm，而1，8-二川芎嗪基大黃酸的最大吸收波長為210、275 nm，其中210 nm左右1，8-二川芎嗪基大黃酸和大黃素吸收較強，在甲醇－0. 1%甲酸水( 78∶22，V/V)流動相條件下大黃酸和蘆薈大黃素分別在5. 31、3. 92 min左右出峰，而大黃素在10. 82 min左右出峰。考慮到血漿中內源性雜質的紫外末端吸收較多，且在5 min左右仍有內源性物質吸收，所以綜合考慮選擇大黃素為內標，275 nm為紫外檢測波長。

藥代動力學研究發現，靜脈注射給藥后1，8-二川芎嗪基大黃酸從大鼠血漿中消除，其T1/2在69 min左右，平均駐留時間( MRT) 85 min左右，而大黃酸大鼠靜脈注射后T1/2約在4 h左右，MRT約在2. 03 h左右，血漿清除率CL約在0. 1 L·kg－1· h－1，表觀分布容積V約在1. 2 L·kg－1左右［8］，經對比發現1，8-二川芎嗪基大黃酸藥物消除較快，半衰期短，體內滯留時間短，而表觀分布容積較改造前大，可能是由于1，8-二川芎嗪基大黃酸親脂性增強。如果根據藥理學研究的需要增加在體內的滯留時間，延長半衰期，可以通過劑型來進行優化。單劑量注射1，8-二川芎嗪基大黃酸高、中、低3種濃度的AUC0－t與所研究的劑量呈現簡單的線性相關( r = 0. 9959，Fig 3)且T1/2基本不變，血漿清除率CL為常數，與給藥劑量無關。初步判斷在所研究的劑量范圍內1，8-二川芎嗪基大黃酸體內藥動學過程符合線性過程。

(致謝:本實驗在安徽中醫藥大學藥物代謝動力學實驗室設計并完成研究，衷心感謝本研究室全體成員對本實驗的大力幫助與支持。)

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Determination of 1，8-TMP rhein and its pharmacokinetics in rat plasma by HPLC

PENG Zhao-liang1，LI Jie1，FAN Ling1，WANG Xue-qi1，HUANG Peng1，LI Jin-cai2，WANG Dian-lei1，2
CHEN Ya-jun1，WANG Shu-jun1，WANG Shan-shan1，ZHANG Yue1
( 1．College of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230031，China; 2．Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou Anhui 236800，China)

Abstract:AimTo develop a HPLC method for the determination of the concentration of 1，8-TMP rhein in rat plasma and study the pharmacokinetics of 1，8-TMP rhein in rat plasma after single dose i．v．administration of 1，8-TMP rhein ( 2，4，8 mg·kg－1)．Methods Emodin was used as an internal standard．Plasma samples were extracted with methanol and analyzed by HPLC．The mobile phase was methanol－0. 1% formic acid water ( 78∶22，V/V)，with a flow rate of 1. 0 mL·min－1and UV 275 nm as the detection wavelength．The plasma concentration of 1，8-TMP rhein in rats was determined by HPLC after single-dose intravenous injection in rats with 2，4 and 8 mg·kg－1of 1，8-TMP rhein，and the pharmacokinetic parameters were caclulated by DAS 2．1．ResultsThe result of calibration curve was linear over the range of 0. 05～10. 00 mg·L－1( r =0. 996 2)．The lower limit of quantification was 0. 05 mg·L－1．The intra-day and inter-day precision ( RSD%) were both lower than 6%，and the extraction recoveries were higher than 88%，respectively．The validated method was successfully applied to a pharmacokinetic study after i．v．administration of 1，8-TMP rhein in rats with a dose of 2，4 and 8 mg· kg－1．The T1/2was ( 68. 35±1. 36)，( 69. 32±2. 1) and ( 69. 32±2. 03) min，respectively．The AUC0－twas ( 101. 03±24. 90 )，( 144. 79±3. 29 ) and ( 231. 92±19. 30) min·mg·L－1，respectively．Conclusion A simple and specific HPLC method for the analysis of 1，8-TMP rhein is successfully developed and applied to a pharmacokinetic study in rat plasma．Key words: 1，8-TMP Rhein; HPLC; rat; pharmacokinetics; plasma concentration; intravenous injection

作者簡介:彭兆亮( 1991－)，男，碩士生，研究方向:藥物代謝動力學，Tel: 0551-68129153，E-mail: 747972445@ qq．com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 81473536) ;安徽省教育廳高等教育振興計劃人才項目(皖教秘［2014］181號)

收稿日期:2015－10－27，修回日期: 2015－11－25

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0109－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．023