干巴菌抗氧化性的研究

劉品華，劉明研，楊 濤，楊 芬*

(1.曲靖師范學院化學化工學院，云南 曲靖 655011；2.廣西百色農業學校，廣西 百色 533000)

干巴菌抗氧化性的研究

劉品華1，劉明研2，楊 濤1，楊 芬1*

(1.曲靖師范學院化學化工學院，云南 曲靖 655011；2.廣西百色農業學校，廣西 百色 533000)

采用Schaal烘箱法誘導氧化，以二丁基羥基甲苯(BHT)為參照，研究干巴菌干粉及乙醇、石油醚提取物抗豬油氧化的效果，用過氧化值(POV)抑制率分析抗氧化持續時間，并測試BHT、干巴菌乙醇提取物的還原能力、清除DPPH自由基的能力和清除羥基自由基的能力。結果表明，抗豬油氧化效果是乙醇提取物(0.2 g/kg)>石油醚提取物(0.2 g/kg)>BHT(0.2 g/kg)>干巴菌干粉(10 g/kg)。抗氧化效果的持續時間乙醇提取物=干粉>BHT>石油醚提取物。乙醇提取物還原能力、清除羥基自由基能力低于BHT，清除DPPH自由基的能力高于BHT，用清除DPPH自由基能力反映抗油脂氧化是合理的。

干巴菌；過氧化值；抗氧化；DPPH自由基

干巴菌(ThelephoraganbajunZang) 主要生長于亞熱帶云南松林或針闊混交林下，為云南特有珍稀野生菌[1]，是一種狹域性分布的可食高等真菌，主要分布在昆明、呈貢、嵩明、安寧、楚雄、易門、保山、曲靖、馬龍等地市(縣) ，其分布區大約在北緯22°～27°，東經99°～106°，集中在海拔1000 ～2200 m的松林中。資料表明，云南省干巴菌年產量超過10 000 t[2-3]。同其它食用菌相比，干巴菌不僅具備獨特、濃郁的鮮香味，也含有大量的營養物質，如氨基酸、蛋白質、黃酮、粗多糖、礦質元素、維生素等，具有很高的營養保健價值[4]。目前在油脂食品工業上一直采用添加BHT、BHA、TBHQ等來抑制氧化酸敗。許多研究指出，這些人工合成的抗氧化劑，大量或長期使用會導致畸形胎和癌癥的發生[5-7]。天然抗氧化劑能有效控制油脂的酸敗和降低有害物質的產生，逐漸被應用于油脂工業中。優良的抗氧化劑不但要有好的抗氧化效果還要有較長的持續時間及安全性[[8-9]。干巴菌抗氧化活性相關的報道較少，為此筆者研究了野生食用干巴菌在豬油中的抗氧效果及還原能力、清除DPPH自由基和清除羥基自由基的能力，旨在探討抗油脂氧化鏈傳遞過程中的情況，為油脂食品工業控制酸敗，探索高效抗氧化劑的篩選，充分開發利用天然干巴菌資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮干巴菌(由云南曲靖馬龍金發酒樓提供)；豬油(農貿市場購買新鮮豬肥膘，實驗室火煉法提取)；1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)(日本原裝進口)；BHT(鄭州龍和化工有限公司,食品級)；水楊酸(天津市化學試劑三廠)；乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)等試劑均為AR級。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司)、電子天平(AL204-IC型，梅特勒-托利多儀器上海有限責任公司)；恒溫培養箱(29SN-DP-501，天津實驗儀器廠)；旋轉蒸發儀(RE-52AAA型，上海伊利儀器制造有限公司)；萬能高速粉碎機(DFY-800C型, 溫嶺市林大機器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理 鮮干巴菌于80 ℃烘干后粉碎過80目篩得原料干粉。原料干粉加入約3倍量的乙醇回流提取2 h后，抽濾。重復提取3次，清液用旋轉蒸發儀濃縮后于80 ℃烘至恒重得乙醇提取物。同法采用石油醚回流提取得石油醚提取物。

1.3.2 抗氧化試驗 豬油融化混勻，取50.0000 g豬油于50 mL比色管中。分別加入0.5000 g原料干粉；0.0100 g乙醇提取物、石油醚提取物、BHT。然后超聲波處理10 min，同時做空白試驗。置于60±1 ℃培養箱中，按誘導氧化設計時間，精密稱取0.0100～1.0000 g試樣于10 mL容量瓶中，按照GB/T5009.37中比色法檢測過氧化值。試驗標準曲線得回歸方程：y=0.0273x-0.0113，R2=0.9990。試驗結果見表1。

1.3.3 評價方法 按文獻[10-11]中相對防效值和Pb值的計算方法做適當修改， 按下列公式計算POV的抑制率( %)，POV抑制率越大說明抗氧化效果越好。POV抑制率穩定下降至試驗結束的斜率值作為評價抗氧化持續時間能力，其值越大說明抗氧化的持續時間能力就越大。計算結果見表2。

POV抑制率(%)=

1.3.4 還原能力的試驗 分別稱取0.3360g，BHT、乙醇提取物用乙醇定溶于100mL容量瓶中，從中取出10mL定容到100mL容量瓶得0.336mg/mL待用溶液。

還原能力的測定：分別取待用溶液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL，于25mL的比色管中，并補充甲醇至0.25mL(及得質量濃度為0.00、67.20、134.40、201.60、268.80、336.00μg/mL的溶液),考慮到實驗樣液的可能影響，采用不加鐵氰化鉀的為對應空白樣。分別加入0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.6)2.50mL和1 %的鐵氰化鉀2.50mL，混合均勻，于50 ℃水浴中反應30min后快速冷卻，加入10 %的三氯乙酸溶液2.50mL，混合均勻(澄清無需離心)。取清液2.50mL于試管中，加入甲醇2.50mL，再加入0.1 %的三氯化鐵溶液0.50mL，混合均勻，于室溫下靜置反應10min，1cm石英比色皿在700.00nm處測定吸光度值。還原能力測定結果見圖1。

1.3.5 清除DPPH自由基試驗 待用溶液配置同1.3.4。稱取20mg的DPPH用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，配制成質量濃度2×10-4mol/L的DPPH溶液，0～4 ℃下避光保存。分別取待用溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL于比色管中，補充乙醇至2mL，然后加入配制好的DPPH溶液2mL混勻(實驗樣液質量濃度8.40、16.80、25.20、33.60、42.00、50.40μg/mL)，于室溫暗處放置反應30min，在517nm下測得的吸光值為A1，以2 mL乙醇代替樣液所測得的吸光值為A2，以2 mL乙醇或水代替DPPH溶液測得的吸光值為A3。實驗結果見圖2。試樣對DPPH的清除率計算如下。

1.3.6 清除羥基自由基試驗 待用溶液配置同1.3.4。分別取待用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL，于25mL的比色管中，各加入6mmol/L硫酸亞鐵2mL，6mmol/L過氧化氫2mL，放置25min后加入6mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，定容至25mL(即樣液測試質量濃度為1.34、2.69、4.03、5.38、6.72、8.06μg/mL)。在常溫反應30min，1cm石英比色皿于510nm處測定吸光度值Ax，以乙醇代替實驗樣液測得吸光度值為Ao，以乙醇代替水楊酸-乙醇組測得吸光度值Axo，以乙醇代替實驗樣液、水楊酸-乙醇的為空白管。對(·OH)的清除率結果見圖3。試樣對羥基自由基的清除率計算如下。

2 結果與分析

表1可知，抗豬油氧化效果：乙醇提取物>石油醚提取物>BHT>干巴菌干粉。乙醇提取物效果明顯高于BHT。表2可看出，POV抑制率大于100 %的時間分別是，乙醇提取物為192 h，石油醚提取物的為144 h，BHT的為96 h，干巴菌干粉的為48 h。初期抑制率大于100 %，說明清除了原料豬油中原有的過氧化物及自由基。清除能力：乙醇提取物>石油醚提取物>BHT>干巴菌干粉，與抗氧化效果的總體表現一致。原因是加入的物質能干擾自由基反應的化學物質和消除自由基，顯著地抑制了脂肪的自動氧化速率，延長脂肪氧化酸敗的引發期，有效控制了油脂的過氧化值[7]。888 h乙醇提取物的抑制率比BHT還高出9 %，石油醚提取物、干巴菌干粉的略高于BHT。隨著誘導氧化時間的延長，POV抑制率逐漸下降，當對照樣的過氧化物進入增值期后POV抑制率又逐漸上升，隨后又逐漸下降。乙醇提取物、干巴菌干粉、BHT、石油醚提取物分別從432、480、480、432 h后抑制率成線性關系逐漸下降，其斜率分別為-0.024、-0.024、-0.029、-0.031，其值大小與抗氧化的持續時間能力成相關性，表明抗氧化效果的持續時間是：乙醇提取物=干巴菌干粉>BHT>石油醚提取物。與抗豬油氧化效果排序不一致的原因可能是：干巴菌干粉中抗氧化有效成分逐漸溶出，表現出較好的持續有效時間能力；而石油醚提取物易溶于油脂，初期消耗抗氧化有效成分過快，隨時間的延長易揮發成分也可能揮發，導致抗氧化效果的持續時間能力下降。

表1 抗豬油氧化POV值

表2 POV抑制率

圖1 乙醇提取物、BHT的還原能力Fig.1 The reduction activity of the ethanol extract and BHT

圖2 乙醇提取物、BHT清除DPPH自由基的能力Fig.2 The scavenging activity to DPPH free radical of the ethanol extracts and BHT

從圖1、圖3可看出，乙醇提取物的還原能力、清除羥基自由基能力明顯低于BHT，與抗油脂氧化能力相反。從圖2可看出，乙醇提取物清除DPPH自由基的能力明顯高于對照樣BHT，與抗油脂氧化能力是一致的。

3 討 論

脂類有酶與非酶氧化兩種機制。熱加工過的油脂，酶氧化不是主要的原因。非酶氧化主要是光敏氧化及自動氧化，并且相互作用，光和產生自由基的物質能催化脂肪自動氧化，產生大量的氫過氧化物，光引發的氧化反應量子產額超過1[12]，油脂氧化物的電極電勢應當大于-2.1065[7]。從脂類中雙鍵的α-位的H原子分裂出來的均裂原子團開始，形成的碳原子團與氧反應生成過氧化原子團，過氧化原子團進入鏈反應形成一級有機過氧化物，過氧化物作為脂類自動氧化的主要初期產物是不太穩定的，它經過復雜的分裂和相互作用，導致產生二級產物，最終形成小分子揮發性物質，如醛、酮、酸、醇、環氧化物或聚合成聚合物。其中溫度越高，過氧化值的結果越高，變化也越快[13]。一級有機過氧化物形成的速率超過其分解速率，而后階段則相反。

圖3 乙醇提取物、BHT清除羥基自由基的能力Fig.3 The scavenging activity to hydroxyl free radical of the ethanol extracts and BHT

鐵氰化鉀法測試還原能力是通過供給電子把三價鐵還原為二價鐵進行測試。還原能力是還原物質給出電子的能力，通過給出電子從而還原具有氧化性的物質，其還原能力大小與被還原物質的氧化能力(得電子能力)有關。脂肪自動氧化遵循自由基機制，干擾自由基反應的物質也能顯著地抑制脂肪自動氧化的速率[12]。測試還原能力的原理與油脂氧化的自由基機理不一致，試驗結果證明用還原能力的大小作為判斷在油脂中抗氧化效果是不可靠的。

DPPH 自由基是一種合成的、具有單電子、以氮為中心的順磁化合物，能穩定存在較長時間，DPPH 法沒有底物，DPPH 自由基能直接獲得，不需通過化學反應制備。脂質氧化生成的脂質自由基R·、過氧自由基ROO·和烷氧自由基RO·與抗氧化劑間發生的反應是氫原子轉移(Hydrogen Atom Transfer，HAT)反應，一般認為DPPH 法與抗氧化劑間的反應也是HAT。而脂質氧化生成的自由基活性高、存在時間短暫[14]，所以能有效清除DPPH自由基的物質一定能有效的抑制油脂中主要鏈傳遞的自由基，降低一級有機過氧化物的形成，具有較好的抗油脂氧化效果，反之則不一定。

油脂羥基自由基在傳遞階段產生[15]，是一種能夠激發油脂過氧化反應的較強氧化劑，羥基自由基清除能力可能是抗氧化劑還原力、供氫能力和活性氧清除能力的綜合體現[16]。但試驗結果乙醇提取物清除羥基自由基的能力不如BHT，而抗油脂氧化的能力比BHT強，說明羥基自由基在油脂氧化的鏈傳遞過程中不是主要因素。

干巴菌乙醇提取物中含有能高效控制油脂氧化的成分，其抗油脂氧化效果和持續時間的能力明顯優于BHT。試驗證明，乙醇提取物的還原能力、清除羥基自由基能力比BHT的低，但有更強的清除DPPH自由基的能力，且與抗油脂的氧化能力一致，說明油脂氧化過程的傳遞主要是脂質自由基R·、烷氧自由基RO·和過氧自由基ROO·，不是羥基自由基。通過測定物質對 DPPH 自由基的清除能力，可以較迅速地評價物質的抗氧化能力[17]，用清除DPPH自由基能力作為判斷抗油脂氧化效果也是比較合理。試驗結果不僅有助于說明抗氧化的主要作用機制，對篩選高效抗氧化劑的研究也有一定的指導意義。進一步對干巴菌乙醇提取物的研究，有望找到抗油脂氧化效果好且安全性高的物質。

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(責任編輯 王家銀)

Study on Antioxidant Activity ofThelephoraganbajun

LIU Pin-hua1, LIU Ming-yan2, YANG Tao1, YANG Fen1*

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Yunnan Qujing 655011, China; 2.Guangxi Baise Agriculture School, Guangxi Baise 533000, China)

The antioxidant effect of dried-powder, ethanol and petroleum ether extracts fromThelephoraganbajunwas studied by Schaal oven induced oxidation method, meanwhile, dibutylhydroxytoluene (BHT) was used as a reference. The duration time of antioxidant effect was analyzed using Peroxide value (POV) inhibitory rate. The reduction activity, scavenging activity to DPPH free radical and hydroxyl free radical of BHT and the ethanol extracts fromT.ganbajunwere tested. The results showed that the sequence of antioxidant effect to the lard was the ethanol extracts (0.2 g/kg) > the petroleum ether extracts (0.2 g/kg) > BHT(0.2 g/kg) > dried-powder(10 g/kg). The order of duration time of antioxidant effect was the ethanol extracts= dried powder > BHT> the petroleum ether extracts. The reduction activity and scavenging activity to hydroxyl free radical of the ethanol extracts was lower than those of BHT, but the scavenging activity to DPPH free radical of the ethanol extracts was higher than that of BHT. It was reasonable that the scavenging activity to DPPH free radical reflects the anti lipid oxidation.

Thelephoraganbajun; Peroxide value; Antioxidant activity; DPPH Free radical

1001-4829(2016)10-2330-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.014

2014-12-17

上海師范大學資源化學省部共建教育部重點實驗室；曲靖師范學院資源與環境化學重點實驗室(SYS2010BX01)

劉品華(1963-)，男，教授，從事食品化學、分析方面的研究工作，E-mail:406051584@qq.com，*為通訊作者，E-mail:yangfen6688@163.com。

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