3種高山杜鵑對低溫的生理響應

黃承玲，趙孝梨，劉廣超

(1. 貴州民族大學 化學與環境科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州民族大學 人文科技學院，貴州 貴陽 550025)

3種高山杜鵑對低溫的生理響應

黃承玲1,2，趙孝梨1，劉廣超2

(1. 貴州民族大學 化學與環境科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州民族大學 人文科技學院，貴州 貴陽 550025)

為探明高山杜鵑的抗寒性機理，促進其新品種選育及開發利用，通過人工控溫方法研究低溫對露珠杜鵑、大白杜鵑和迷人杜鵑葉片抗氧化酶活性及滲透調節物質、可溶性蛋白質和丙二醛(MDA)含量的影響。結果表明：隨脅迫溫度的降低，3種杜鵑葉片SOD活性呈下降后上升再下降趨勢。其中，10 ℃時迷人杜鵑葉片SOD活性為對照的87.7 %。大白杜鵑葉片POD活性呈上升趨勢，0 ℃時POD活性為對照的1.58倍；迷人杜鵑和露珠杜鵑葉片POD活性呈先上升后下降趨勢。3種杜鵑葉片滲透物質含量呈上升趨勢。大白杜鵑和迷人杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量呈先上升后下降趨勢。露珠杜鵑葉片可溶性蛋白質的含量呈持續上升趨勢。3種杜鵑葉片的MDA含量和質膜相對透性均呈上升趨勢，且大白杜鵑的MDA含量和質膜相對透性較其他2種高，0 ℃時大白杜鵑、迷人杜鵑和露珠杜鵑葉片的MDA含量依次為18.97、12.5和9.97 nmol/mg。露珠杜鵑和迷人杜鵑的抗寒能力比大白杜鵑強。

高山杜鵑；低溫；抗氧化酶活性；可溶性蛋白質含量；丙二醛含量；質膜相對透性

高山杜鵑花多且艷，樹形美觀，具有較高的園林觀賞價值，在西方園林里具有重要地位，在國內的園林利用也漸漸興起。全世界高山杜鵑有1000種左右，我國是主要分布中心之一。原產于我國的高山杜鵑種類達570余種，除新疆和寧夏外，其余省市均有自然分布。朱紅等[1]研究發現，受不同海拔(800～5000 m)高度各類立地氣候條件的長期影響，杜鵑形成了各種不同的生態型，其對低溫寒害均產生了一定的抗性。有研究表明，寒冷溫度對杜鵑栽培利用與地理分布密切相關。因此，為了更加科學的應用高山杜鵑，研究其抗寒機理對其開發利用具有重要意義。國外對高山杜鵑抗寒機理的研究開展得較早，但國內對高山杜鵑抗寒性的研究起步較晚。余麗玲等[2-3]研究了低溫對西洋杜鵑生理生化指標及葉片葉綠素熒光的影響；張艷紅等[4-5]對遼寧的杜鵑種類的耐寒性進行調查評價，并研究了低溫對丹東杜鵑花期的影響；劉旭穎等[6-7]分析了遼寧地區9種耐寒杜鵑的親緣關系，并研究其葉片結構的差異；鮑思偉[8-9]研究了云錦杜鵑(RhododendronfortuneiLindl.)在自然降溫過程中水分、滲透調節物質的動態變化，探討這些物質的動態變化及其與低溫半致死溫度間的關系；熊燕等[10]探討了低溫脅迫對4種高山杜鵑雜交品種生理的影響。可見，已有的相關研究涉及的杜鵑種類較少，區域較窄。貴州省百里杜鵑自然保護區分布有43種杜鵑[11]，其中，露珠杜鵑、大白杜鵑和迷人杜鵑是主要的保護和觀賞對象，加之保護區是全國杜鵑天然雜交區域，雜交常發生在常綠杜鵑亞屬的種類之間，是培育杜鵑新品種的寶貴資源。為此，筆者選取保護區內自然分布的3種常綠杜鵑亞屬的杜鵑為研究對象，通過測定人工低溫脅迫條件下其葉片的抗寒性相關生理指標，綜合評價3種高山杜鵑的抗寒性，旨在為其耐寒品種選育和開發利用提供依據。

表1 露珠杜鵑、大白杜鵑和迷人杜鵑的生物學特性

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用露珠杜鵑、大白杜鵑和迷人杜鵑3種高山杜鵑的3年生幼苗作為試驗材料，幼苗取自百里杜鵑保護區的育苗基地，苗木生長正常，其花與葉片特性見表1[11]。

1.2 試驗設計

2010年4月分別將3種杜鵑長勢一致的3年生實生幼苗移植于普通塑料花盆內(上口徑、下口徑和高分別為300、200和250 mm)，每盆1株，每種54盆。栽培基質為普通園土，每盆盛土5.0 kg，種植后進行常規管理。

抗寒性試驗于2010年6月在人工氣候箱中進行。試驗設5個處理，分別為20(CK)、15、10、5和0 ℃，培養箱空氣相對濕度80 %，每天光照12 h，光強約15 000 lx。每個處理3株，3次重復。試驗期間及時補充水分，觀察記錄葉片形態變化。

1.3 生理指標測定

處理10 d后取葉測定相關生理生化指標。摘取同一方向的中部葉3～4片，去除葉柄裝袋編號封存，置入冰桶中帶回實驗室后，立即剪碎分別按種類混合均勻后測試樣品的理化指標，測定酶活性和丙二醛(MDA)取樣0.2 g，測定可溶性蛋白質含量時取樣0.4 g，測定游離脯氨酸和可溶性糖含量時取樣0.1 g。

質膜透性采用相對電導率法[12]，酶活性及MDA含量采用南京建成生物有限公司的試劑盒測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定以其抑制氮藍四唑(NBT)光反應50 %為1個單位酶活性(單位為U/mg)；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定，以每1 min OD470增加0.1為1個單位酶活性，POD單位為U/(mg·min)；MDA測定采用TBA法，單位為nmol/mg。可溶性蛋白質、游離脯氨酸和可溶性糖的測定參照文獻[13]的方法，可溶性蛋白質用考馬斯亮藍法測定，游離脯氨酸測定采用酸性茚三酮比色法，可溶性糖的測定采用葸酮比色法。

1.4 數據統計與分析

試驗數據用SPSS進行方差分析，運用Duncan氏新復極差法進行處理間差異顯著性分析。所有數據用 Excel軟件進行處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫3種杜鵑葉片的外部形態

逆境條件下植物外部形態尤其是葉片有明顯的變化，觀察葉片受損程度是評價植物對逆境抗性強弱最為可靠和直接的指標，0～10 ℃低溫會使植物葉片出現變色、壞死等寒害癥狀。試驗中，0～20 ℃3種杜鵑葉片均未出現寒害癥狀，表明3種杜鵑具有一定的抗低溫寒害能力。

圖1 低溫脅迫3種杜鵑葉片的抗氧化酶活性Fig.1 Antioxidant enzyme activities of Rhododendron leaves under low temperature stress

2.2 低溫脅迫幼苗葉片的抗氧化酶活性

2.2.1 SOD活性 隨脅迫溫度的降低，葉片SOD活性呈先下降后上升再下降趨勢(圖1)，其中，大白杜鵑葉片SOD活性明顯低于其余2種杜鵑，差異達極顯著(P<0.01)；露珠杜鵑與迷人杜鵑葉片的SOD活性無顯著差異。從變化幅度看，15～10 ℃時大白杜鵑SOD活性分別為287.06和276.59 U/mg，與對照(296.28 U/mg)相比下降幅度不大；5 ℃時SOD活性為308.13U/mg，是對照的1.04倍；0 ℃時SOD活性為303.76U/mg，再次小幅下降，但4種低溫度處理間SOD活性差異不顯著。迷人杜鵑葉片SOD活性在10 ℃時迅速降至393.73 U/mg，為對照(448.76 U/mg)的87.7 %，5 ℃時活性上升至對照水平，0 ℃時活性又降至381.88 U/mg，4種低溫度處理間SOD活性無顯著差異。15～10 ℃時露珠杜鵑葉片SOD活性下降幅度較小，活性分別為對照(520.71 U/mg)的99.8 %和98.6 %，5 ℃時活性是對照的1.05倍，在0 ℃時其活性較對照小幅下降，4種低溫度處理間SOD活性無顯著差異。

2.2.2 POD活性 隨脅迫溫度的降低，大白杜鵑葉片POD活性呈上升趨勢(圖1)，迷人杜鵑和露珠杜鵑呈先增加后下降的變化趨勢；露珠杜鵑葉片POD活性極顯著高于其他2種杜鵑，迷人杜鵑葉片POD活性極顯著高于大白杜鵑。15、10、5和0 ℃時大白杜鵑葉片POD活性分別為對照(7.11 U/mg·min)的1.02、1.19、1.40和1.58倍，變化不大，與對照無顯著差異。溫度降至5 ℃時，迷人杜鵑葉片POD活性上升至44.5 U/mg·min，與對照(19.56 U/mg·min)差異達極顯著。溫度分別降至10、5和0 ℃時，露珠杜鵑葉片POD活性分別為對照(42.70 U/mg·min)的1.7、2.1和2.0倍，與對照差異均達極顯著。

2.3 低溫脅迫幼苗葉片主要生化指標的含量

2.3.1 可溶性糖 隨脅迫溫度的降低，3種高山杜鵑葉片的可溶性糖含量均呈上升趨勢(圖2)，露珠杜鵑葉片的可溶性糖含量低于其他2種杜鵑。15～0 ℃時，大白杜鵑葉片的可溶性糖含量分別比對照(27.53 mg/g FW)增加3.16、3.41、4.73和5.37 mg/g FW，但與對照差異不顯著。迷人杜鵑葉片的可溶性糖含量分別為對照(16.58 mg/g FW)的1.3、1.4、1.5和1.7倍，與對照差異均達極顯著。露珠杜鵑葉片的可溶性糖含量分別比對照(14.59 mg/g FW)增加2.46、4.23、4.46和8.43 mg/g FW，與對照差異均達極顯著。

2.3.2 脯氨酸 隨脅迫溫度的降低，3種高山杜鵑葉片的脯氨酸含量均呈上升趨勢。15～0 ℃時，大白杜鵑葉片的脯氨酸含量分別是對照(104.98 μg/g FW)的1.0、1.1、1.2和1.4倍，但差異不顯著。迷人杜鵑葉片的脯氨酸含量分別較對照(70.86 μg/g FW)增加32.88、35.98、54.23和88.49 μg/g FW，與對照差異達極顯著。15～5 ℃時露珠杜鵑葉片的脯氨酸含量分別是對照(134.38 μg/g FW)的1.05、1.06和1.12倍；0 ℃時，脯氨酸含量為206.24 μg/g FW，與對照差異達極顯著。

2.3.3 可溶性蛋白質 隨脅迫溫度的降低，大白杜鵑和迷人杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量呈先增高后下降趨勢(圖2)，露珠杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量則呈持續上升趨勢。大白杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量在15 ℃增至3.68 mg/g FW，而后隨溫度降至10～0 ℃，其含量分別降至2.97、2.76和2.77 mg/g FW，4種低溫處理與對照(2.69 mg/g FW)均無顯著差異。迷人杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量在15～10 ℃時分別升至4.85和5.48 mg/g FW，與對照(3.54 mg/g FW)差異不顯著(P<0.05)；5～0 ℃時可溶性蛋白質含量為3.94和2.84 mg/g FW，與對照相比沒有顯著差異。露珠杜鵑葉片的可溶性蛋白質含量在15～0 ℃時分別比對照(3.65 mg/g FW)增加0.59、0.65、1.02和1.35 mg/g FW，但與對照均無顯著差異。

2.3.4 丙二醛 隨溫度降低，3種高山杜鵑葉片的MDA含量呈上升趨勢(圖2)，且大白杜鵑含量明顯高于其他2種杜鵑，差異顯著。15～10 ℃時，大白杜鵑葉片的MDA含量增幅不大，分別較對照(13.55 nmol/mg)增加1.68和2.11 nmol/mg；5～0 ℃時，含量分別是對照的1.3倍、1.4倍，與對照差異達極顯著。迷人杜鵑葉片的MDA含量在15～0 ℃時分別為10.48、11.02、11.7和12.5 nmol/mg，與對照(8.75 nmol/mg)無顯著差異。露珠杜鵑葉片的MDA含量在15～5 ℃時增幅不大，分別比對照(6.69 nmol/mg)增加1.0、1.16和1.43 nmol/mg，與對照無顯著差異；0 ℃時其含量升至9.97 nmol/mg，是對照的1.5倍，二者差異達極顯著。

圖2 低溫脅迫3種杜鵑葉片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白質、丙二醛的含量和質膜相對透性Fig.2 Contents of soluble sugar, proline, soluble protein, MDA and the relative membrane permeability of Rhododendron leaves under low temperature stress

2.3.5 質膜相對透性 隨溫度降低，高山杜鵑葉片的質膜相對透性呈持續上升趨勢(圖2)，且大白杜鵑葉片的質膜相對透性高于其他2種杜鵑。大白杜鵑葉片的質膜相對透性在15～0 ℃時分別較對照(31.59 %)上升3.0 %、4.1 %、4.8 %和9.1 %，與對照無顯著差異。迷人杜鵑葉片的質膜相對透性在15～0 ℃時分別較對照(24.8 %)上升1.0 %、1.5 %、2.2 %和4.2 %，與對照無顯著差異。露珠杜鵑葉片的質膜相對透性在15～10 ℃時分別較對照(21.6 %)上升1.3 %和3.2 %，與對照無顯著差異；5 ℃時，較對照上升4.2 %，二者差異顯著；0 ℃時，葉片的質膜相對透性迅速上升至31.8 %，與對照差異達極顯著。

3 結論與討論

脯氨酸和可溶性糖是重要和有效的有機滲透調節物質，二者含量和植物抗寒性密切相關，在植物可忍受的低溫脅迫時含量呈上升趨勢[16-17]。3種杜鵑葉片的可溶性糖和脯氨酸含量隨溫度的下降而上升，該變化趨勢與李松等[18-19]的研究結果一致。但迷人杜鵑和露珠杜鵑葉片可溶性和脯氨酸含量對低溫的響應明顯，表明低溫刺激這2種杜鵑葉片滲透有機調節物質，以提高細胞液濃度，降低滲透勢，從而減輕低溫對細胞膜的傷害。

一般情況下，可溶性蛋白質的含量隨溫度的降低而增加[20]。大白杜鵑和迷人杜鵑在低溫脅迫時葉片的可溶性蛋白質含量隨溫度降低呈先上升后下降趨勢，與李鵬程等[21]的研究結果一致；露珠杜鵑葉片可溶性蛋白質含量則持續上升，與鄧菊慶等[19]的研究結果一致，且露珠杜鵑的可溶性蛋白質明顯高于大白杜鵑。

植物在逆境脅迫下產生過剩自由基會引發或加劇膜質過氧化作用，MDA是脂質過氧化作用的直接產物，其含量能反映細胞脂膜過氧化作用強弱和植物受傷害程度。3種高山杜鵑葉片MDA的含量隨溫度降低呈上升趨勢，與鄧菊慶等[19]研究結果類似。大白杜鵑葉片MDA含量明顯高于其他2種杜鵑。3種高山杜鵑葉片的質膜相對透性隨溫度的降低呈持續上升趨勢，大白杜鵑葉片的質膜相對透性高于其他2種杜鵑。說明大白杜鵑葉片細胞膜受低溫傷害程度比其他2種杜鵑大。

綜上所述，露珠杜鵑和迷人杜鵑的抗寒能力比大白杜鵑強，可能是因為大白杜鵑的葉比其他2種杜鵑的大且薄，低溫受害的表面積相對較大，露珠杜鵑的葉片較小且厚，而迷人杜鵑的葉片背面密被絨毛。此外露珠杜鵑和迷人杜鵑葉片的革質化程度比大白杜鵑高。因此，需要進一步從葉片微觀結構的變化深入研究低溫對高山杜鵑的影響。

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(責任編輯 王 海)

Physiological Responses of Three Species ofRhododendronunder Low Temperature

HUANG Cheng-ling1,2, ZHAO Xiao-li1, LIU Guang-chao2

(1. College of Chemistry and Environmental Science, Guizhou Minzu University, Guizhou Guiyang 550025,China; 2. College of Humanities and Sciences, Guizhou Minzu University, Guizhou Guiyang 550025, China)

In order to find out the mechanism of cold resistance ofRhododendronand promote the development and utilization of new varieties, the activities of antioxidant enzymes, the content of osmotic adjustment substance, soluble protein and MDA of threeRhododendronspecies were measured through artificial temperature control. Results:with decreasing temperature, SOD activity ofRhododendrondescend first, then ascend, and descend at last. At 10 ℃, SOD activity ofR.agastumwas 87.7 % of the control. POD activity ofR.decorumraised constantly, POD activity was 1.58 times of the control at 0 ℃. But POD activity ofR.agastumandR.irroratumincreased first and then decreased. The content of soluble sugar and proline increased, the soluble protein content ofR.decorumandR.agastumascend first, then descend last. However, the soluble protein ofR.irroratumincreased constantly. The relative membrane permeablility of them were enhanced constantly, and MDA content continually increased. MDA content and relative membrane permeability ofR.decorumwere higher than that of the other two species, MDA content ofR.decorumwas 18.97 nmol/mg at 0 ℃, MDA content ofR.agastumandR.irroratumwere 12.5 nmol/mg and 9.97 nmol/mg respectively. The cold resistance ofR.irroratumandR.delavayiwere stronger thanR.decorum.

Rhododendron; Low temperature; Antioxidant enzymes activity; Soluble protein content; Malondialdehyde content; Relative membrane permability

1001-4829(2016)10-2346-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.017

2016-01-15

貴州省科技廳國際科技合作項目“百里杜鵑杜鵑屬植物種類與變異研究”[黔科合體外J字(2013)7035]；貴州民族大學引進人才項目“高山杜鵑引種及應用示范研究”(15XRY011)

黃承玲(1977-)，女，副教授，博士，從事木本花卉的生理生態研究，E-mail:chenglinghuang@163.com。

S685.21;Q945.78

A