大鼠尾椎間盤髓核細胞的分離、培養與鑒定

朱厚毅，王運濤，王鋒，時睿，康新桂，崔佳瞿

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京　210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科，江蘇 南京　210009)

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大鼠尾椎間盤髓核細胞的分離、培養與鑒定

朱厚毅1，王運濤2，王鋒1，時睿1，康新桂1，崔佳瞿1

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：利用單純Ⅱ型膠原酶消化法從大鼠尾椎間盤獲取髓核細胞，拓展組織工程髓核細胞的獲取途徑。方法：單純Ⅱ型膠原酶消化法分離培養大鼠尾椎間盤髓核細胞，鏡下觀察細胞形態，行HE、甲苯胺藍、免疫組化及免疫熒光染色鑒定觀察；取原代和傳代細胞行細胞活性檢測；取P1代細胞檢測，繪制生長曲線并行細胞周期分析。結果：成功分離出大鼠尾椎間盤髓核細胞。P0代細胞中包含多角形類軟骨樣細胞、體積大且胞漿中含有大量空泡的脊索樣細胞；經傳代純化后最終得到較高純度的軟骨樣髓核細胞。臺盼藍細胞活力測定P0代活力高達99%，到P3代細胞活力稍下降，為95%~97%。細胞生長曲線及周期測定示P1代細胞有較強增殖潛能，活力旺盛。胞漿內蛋白聚糖被甲苯胺藍染成天藍色，免疫組化呈陽性，表現為黃褐色沉淀；Ⅱ型膠原免疫熒光染色示強陽性表達。結論：大鼠尾椎髓核組織可以提供代謝旺盛、維持類軟骨表型的髓核細胞。

[關鍵詞]尾椎間盤； 髓核細胞； Ⅱ型膠原； 組織工程

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要致病因素之一，包括椎間盤突出、椎管狹窄及脊柱不穩等。不僅給患者帶來痛苦，也給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔[1- 3]。IDD是多因素參與的慢性過程，相關研究表明，髓核細胞(nucleus pulpusus cells，NPCs)的過早衰老與凋亡在此過程中起著核心作用，主要表現為退變椎間盤內NPCs功能降低和數量減少，使得其Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等基質分泌量下降，最終導致椎間盤維持脊柱高度、承受各方應力等生物力學功能喪失[4]。

目前對IDD的治療主要分手術和非手術方法，但都不能從根本上延緩、治療椎間盤退變。近年來有望從根本上克服治療IDD難題的細胞移植療法逐漸成為研究熱點，其中NPCs是研究椎間盤退變病因與修復原理的重要種子細胞[5- 7]。因此體外高效獲取大量純度高、活性好的NPCs成為實驗研究的關鍵。本實驗應用單純膠原酶法從大鼠尾椎髓核組織分離純化原代NPCs，鑒定其軟骨細胞表型，期望能為椎間盤退變機制研究提供穩定的細胞來源，拓展組織工程NPCs的獲取途徑。

1材料和方法

1.1材料

8周齡SPF級Sprague- Dawley大鼠20只，雌雄不限，平均體重(200±25) g，南京醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(蘇)2008- 0004。

胎牛血清、0.25%胰酶(含0.01%EDTA)、Ⅱ型膠原酶(美國Gibco)，DMEM/F12培養基、青霉素- 鏈霉素(美國Hyclone)，臺盼藍、甲苯胺藍(Biosharp)，DAPI染液、FITC標記的二抗、免疫組化試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、CCK- 8試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體、蛋白聚糖抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，酶標儀(美國BIO.RAD)，細胞培養箱、超低溫冰箱(美國Thermo)，倒置相差熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.2尾椎間盤NPCs的分離、培養及傳代純化

200~250g健康8周齡雄性SD大鼠麻醉處死,乙醇浸泡消毒5 min，沿尾部剪開皮膚，撕脫后從根部離斷，置碘伏中轉移至超凈臺；無菌生理鹽水反復沖洗至澄清,去除附著筋膜軟組織，暴露各節段尾椎椎間盤；切開外層纖維環，將膠凍狀髓核完整取出，放入盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養皿中，將其進一步剪碎至1mm×1mm×1mm大小，1500r·min-1離心5min，棄上清；置5倍體積的0.1%Ⅱ型膠原酶內37℃恒溫震動消化5h，組織塊大部分消失， 1500r·min-1離心5min，棄上清；用含體積分數10%胎牛血清、1%青霉素- 鏈霉素的DMEM/F12完全培養基重懸沉淀，懸液均勻接種至細胞培養瓶中；置于37℃、飽和濕度、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養，4d后首次換液，以后每3d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態、記錄貼壁時間、融合時間等。細胞達90%融合后傳代，PBS洗滌1次，0.25%胰酶(含0.01%EDTA)室溫消化，待鏡下見細胞皺縮、大部分細胞變圓漂浮時，立即用等量完全培養液終止消化；滴管輕輕吹打，制成細胞懸液。1500r·min-1離心5min，棄上清，重懸后，以1∶2的比例傳代接種至新培養瓶,置于培養箱中繼續培養。

1.3尾椎間盤NPCs活力測定

取原代及傳代后的NPCs行臺盼藍染色實驗。細胞收集方法同傳代，PBS重懸洗滌1次，離心，最后1 ml PBS重懸細胞。取500μl細胞懸液移入離心管中，加入500μl 4%臺盼藍溶液混勻。用計數板分別計數死細胞和活細胞數。倒置相差顯微鏡觀察，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。計數4大格藍染和未藍染細胞個數，計數3次，取均值計算細胞活力。細胞活力=未藍染細胞/(藍染細胞+未藍染細胞)×100%。

1.4尾椎間盤NPCs生長曲線

取P1代生長狀態良好的尾椎NPCs，P1代腰椎NPCs作為對照。消化收集細胞，計數，取12塊96孔板，以2×103孔-1密度接種于孔板中，將孔板至于細胞培養箱中培養。每天取1個孔板，加入10μl·孔-1CCK- 8溶液，孵育4h后用酶標儀測定其在450nm處的吸光度值并記錄。以培養時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.5尾椎間盤NPCs細胞周期檢測

選取P1代細胞，調整細胞密度為2.5×106L-1，取體積分數70%的預冷乙醇固定，4℃過夜，棄固定液，PBS洗滌1次，加入100μl RNaseA，37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光反應30min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6尾椎間盤NPCs鑒定

1.6.1NPCs HE染色取細胞爬片置于六孔板內，取尾椎NPCs爬片，完成后去除培養液，PBS沖洗5 min3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS沖洗5 min 3次。蘇木精染色5 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化30 s，流水沖洗；伊紅染色3 min，蒸餾水稍洗3 s；體積分數95%乙醇分色至胞漿呈桃紅色。梯度酒精脫水，透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.6.2NPCs甲苯胺藍染色細胞爬片及固定如1.6.1所述，經固定處理后，PBS沖洗爬片5 min 3次，加1%甲苯胺藍染色30 min，PBS沖洗3min，梯度酒精脫水，透明，封固。光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.6.3NPCs蛋白聚糖免疫組化染色細胞爬片及固定如1.6.1所述，固定處理后PBS沖洗5 min 3次，0.1% TritonX- 100/TBST溶液孵育10 min，PBS沖洗5 min 3次，3%H2O2室溫下孵育 10 min，PBS沖洗5 min 3次，滴加山羊血清，室溫下孵育 10 min。去除血清，滴加 1∶200 兔抗大鼠蛋白聚糖單克隆抗體，以PBS替代一抗作為陰性對照，濕盒4 ℃過夜。PBS 沖洗5 min 3次。滴加辣根過氧物酶標記的二抗，室溫孵育 30 min，PBS沖洗5 min 3次，滴加鏈霉素抗生物素- 過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min 3次；使用二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應時間。蘇木精復染，沖洗，脫水封片。

1.6.4NPCsⅡ型膠原蛋白免疫熒光染色細胞爬片及固定如1.6.1所述，去除多聚甲醛，PBS沖洗5 min 3次，0.1% TritonX- 100/TBST溶液孵育10 min，PBS沖洗5 min 3次，1%BSA/TBST溶液孵育1 h，滴加 1∶200 兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體，以PBS替代一抗作為陰性對照，濕盒4 ℃過夜。PBS 沖洗5 min 3次，滴加FITC標記的二抗1 h， PBS沖洗5 min 3次，復染DAPI 3 min，PBS沖洗5 min 3次，加抗熒光淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.7統計學處理

2結果

2.1尾椎間盤NPCs分離培養及形態學觀察

取到的髓核組織呈半透明膠凍樣，剪成1mm×1mm×1mm大小后，經 Ⅱ 型膠原酶消化，可成功分離大鼠尾椎NPCs，倒置顯微鏡下觀察培養液中懸浮未貼壁的類圓形NPCs及細胞團(圖1A)。培養24h后有細胞及細胞團塊貼壁：一種是體積巨大、形態不規則、胞漿內存在大量液泡樣結構的脊索細胞(圖1B)，傳代后逐漸減少，到P2代細胞時基本消失；另一種細胞或細胞團體積較小，屬類軟骨樣細胞，培養48~72h可見貼壁生長，呈集落樣分布生長，該細胞體積較小，形態較規則，呈多角形或短梭形，胞內無明顯液泡樣結構，傳代后貼壁時間縮短到6~8h，且生長迅速(圖1C)。

A.分離后尚未貼壁的NPCs(×100)； B.體積大，不規則，胞漿內有大量液泡的脊索細胞(×100)； C.集落樣分布、多角形的類軟骨細胞(×100)

圖1原代培養的大鼠尾椎間盤NPCs

Fig 1Primary cultured rat caudal disc nucleus pulposus cells

2.2尾椎間盤NPCs活力測定、生長曲線及細胞周期分析

臺盼藍排斥實驗可見原代尾椎間盤NPCs活力良好，細胞活性在97～99%。細胞首次傳代，細胞活力為98%～100%，P2、P3代細胞活性為95%～97%。傳代后最快貼壁時間可縮短到8~12h，細胞貼壁效率高且生長迅速。增長曲線顯示，兩組細胞生長曲線基本為S形，尾椎髓核細胞潛伏適應期較短，培養2d細胞生長進入指數增長期；9~10d細胞出現融合，進入平臺期；腰椎髓核細胞培養3~4d進入對數生長期。培養后1~3d，兩組A值差異無統計學意義(P>0.05)，4~11d，尾椎組A值高于腰椎組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A。流式細胞儀分析結果顯示，P1代尾椎間盤NPCs有70.97%處于G0/G1期，15.16%處于G2/M期，13.87%處于S期，表明P1代尾椎間盤NPCs有較強的分裂增殖潛能，細胞活力旺盛，見圖2B。

A.P1代NPCs生長曲線； B.P1代NPCs周期分析

圖2細胞周期分析及生長曲線

Fig 2Cell cycle analysis and growth curve

2.3尾椎間盤NPCs的鑒定結果

HE染色結果顯示，尾椎NPCs大體以梭形和多角形為主，細胞核位于細胞中央，大而完整，呈藍黑色，胞漿呈現水粉色(圖3A)；甲苯胺藍染色結果顯示，NPCs胞質內蛋白聚糖染色后呈天藍色，越靠近細胞核處，蛋白聚糖染色越深(圖3B)。蛋白聚糖免疫組化染色顯示，核周圍可見濃染顆粒樣物質，被染成棕黃色的蛋白聚糖位于胞質內，離核越近染色越深，與甲苯胺藍結果較一致，胞核復染為藍色(圖3C)；Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示，通過FITC標記被染成綠色的Ⅱ型膠原蛋白呈強陽性表達，在近胞核時熒光逐漸增強，周圍可見顆粒狀染色，DAPI復染胞核為深藍色，光滑完整呈卵圓形(圖4)。

A.NPCs HE染色(×200)； B.NPCs甲苯胺藍染色(×200)； C.NPCs蛋白聚糖免疫組化染色(×200)

圖3尾椎NPCs HE、甲苯胺藍染色及蛋白多糖免疫組化染色

Fig 3HE， toluidine blue and aggrecan immunohistochemistry staining of the nucleus pulposus cells

3討論

圖4尾椎間盤NPCsⅡ型膠原蛋白免疫熒光染色

Fig 4Immunofluorescence staining of collagen type Ⅱ protein in nucleus pulposus cells

近幾年NPCs移植治療IDD的實驗研究顯示，NPCs移植可以延緩椎間盤退變。有將NPCs直接或通過端粒酶逆轉錄酶、TGF-β3等基因修飾后移植到退變椎間盤，恢復NPCs的數量等級，可以明顯地促進蛋白多糖和膠原蛋白的合成，有效地維持椎間盤高度和MRI圖像上的椎間盤信號，從而延緩椎間盤退變[8- 10]。A.Ⅱ型膠原免疫熒光染色(×200)； B.胞核DAPI復染呈藍色(×200)； C.Ⅱ型膠原免疫熒光合并圖(×200)

另一項長達3年的臨床試驗研究表明，將活化后的NPCs植入退變椎間盤，MRI顯示無任何不良反應；也未報道有腰痛癥狀等，顯示NPCs移植安全性良好，一定程度上可以緩解椎間盤退變[11]。國內趙獻峰等[12]比較NPCs移植和MSCs移植對IDD作用研究發現，NPCs移植組術后8周MRI示T2信號強度顯著高于MSCs移植組，提示NPCs移植組較MSCs移植組顯示出更強的基質合成能力，椎間盤高度及含水量出現恢復的跡象。隨著對IDD研究的不斷深入，NPCs移植修復退變椎間盤將會是一種重要的治療手段[13]。

NPCs主要包括脊索殘留細胞與軟骨樣細胞，脊索細胞存在于胚胎期的髓核內，出生后逐漸減少，并最終隨著個體的發育成熟而逐漸消失，最終被軟骨樣細胞所替代[14]。有研究表明,脊索細胞通過表達TGFβ1、金屬蛋白酶組織抑制因子、結締組織生長因子等多種因子修復退變椎間盤，并維持著椎間盤的自我更新[15]。而軟骨樣細胞主要以分泌蛋白聚糖及膠原蛋白為主。因此能夠大量高效地體外分離和培養獲得較高純度及活性的NPCs對于研究其功能及其在IDD中相應的病理改變起到不可或缺的作用。

原代NPCs消化方法主要包括復合酶消化法和單純Ⅱ型膠原酶消化法。復合酶消化法操作煩瑣，增加了被污染的機率；同時由于酶的活性不同，使得各自作用時間及濃度難以摸索，成功率低；而且在消化過程中易損害已消化細胞的活力，所獲的細胞后續生物學性能差，不能確保后續實驗的順利進行，并影響實驗數據的可靠性[16]。而單純Ⅱ型膠原酶消化法操作相對簡便實用，對細胞影響較小，獲取細胞量也較多[5]。本實驗通過對單純酶消化法稍做改進，實驗中通過振動儀提高消化效率、避免吸管反復吹打以減少污染的機率，減少消化時間以降低酶對細胞的損傷，放棄篩網過濾以減少可貼壁細胞團塊的損失及污染機會，最大限度保留了標本中的NPCs數量及活性，保證了NPCs培養的高成功率。而且本實驗取材于大鼠尾椎，簡便實用，節段數量比腰椎多，髓核組織豐富，本實驗結果證明了所獲取的尾椎軟骨樣NPCs的數量及活力均符合實驗要求，增殖能力優于同代腰椎NPCs。大鼠尾椎間盤可以為實驗提供足夠數量狀態好的NPCs。

NPCs目前缺乏特異性的鑒定方法，但因其具有類軟骨細胞的特征，所以這些特征被廣泛作為基本鑒定方法[17]。本實驗最終獲得較高純度的軟骨樣細胞。經病理學處理后，行HE、甲苯胺藍、免疫組化及熒光染色鑒定。甲苯胺藍染色與免疫組化表明大鼠尾椎間盤NPCs強表達蛋白聚糖，證實了所獲細胞保持了高純度的類軟骨細胞的表型。免疫熒光鑒定結果顯示Ⅱ型膠原蛋白強表達于胞漿。本實驗通過Ⅱ膠原酶法分離大鼠尾椎間盤NPCs，簡便實用、消化時間短、細胞活力好、純度高、數量多，鑒定表明其維持了類軟骨細胞表型，可作為動物實驗細胞移植或體外研究IDD的種子細胞。

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Isolation，culture and identification of rat caudal disc nucleus pulposus cells

ZHU Hou- yi1，WANG Yun- tao2，WANG Feng1，SHI Rui1，KANG Xin- gui1，CUI Jia- qu1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofSpinalSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective: To isolate nucleus pulposus cells from rat caudal disc by Ⅱ collagenase and extent the way of access to nucleus pulposus cells for tissue engineering. Methods: Nucleus pulposus from rat caudal disc were collected to extract nucleus pulposus cells by solo Ⅱcollagenase. The morphology and growth of nucleus pulposus cells was observed under the inverted phase contrast microscope everyday. And the growth curve was draw. Cell morphology and expressions of collagenⅡ and aggrecan were observed by HE staining，toluidine blue staining， immunohistochemical staining and immunofluorescence staining. Trypan blue staining was performed to determine the cell viability of primary and subcultured cells. Cell cycle was detected by flow cytometry. Results: The nucleus pulposus cells were successfully isolated from rat caudal disc. The cultured primary nucleus pulposus cells were consisted of round or polygonal chondrocyte- like cells and irregular notochord cells which large in size and full of vacuoles. High purity nucleus pulposus cells with the chondrocyte- like phenotype could be obtained while the cell passaged more times. Trypan blue staining showed that the primary cell viability was 99%， and P3 cell was 95%- 97%. The growth curve and cell cycle analysis indicated that P1 cells proliferated rapidly and vigorously. Aggrecan in the nucleus pulposus cells could be stained as azure and brown respectively by toluidine blue and immunocytochemistry. Immunofluorescence staining showed strongly positive expressions of collagenⅡ. Conclusion: In vitro isolating and culturing the rat caudal disc nucleus pulposus cells with strong activity and maintaining the chondrocyte- like phenotype by solo Ⅱcollagenase is a feasible scheme.

[Key words]caudal disc; nucleus pulposus cells; collagenⅡ; tissue engineering

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．001

[中圖分類號]R681

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0001- 06

[通信作者]王運濤E- mail：wangyttod@seu.edu.cn

[作者簡介]朱厚毅(1989-)，男，山東德州人，在讀碩士研究生。E- mail：houyi916@163.com

[基金項目]國家自然科學基金面上項目(31070876，81272035)；國家自然科學基金青年科學基金項目(81201423)；江蘇省醫學創新團隊和領軍人才項目(LJ201145)

[收稿日期]2015- 06- 29[修回日期] 2015- 10- 29

[引文格式] 朱厚毅，王運濤，王鋒，等.大鼠尾椎間盤髓核細胞的分離、培養與鑒定[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：1- 6.

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