肌源干細胞治療周圍神經損傷的研究進展

劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱　150081)

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肌源干細胞治療周圍神經損傷的研究進展

劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱150081)

[摘要]周圍神經損傷是常見的外科疾病之一，為了尋求促進周圍神經損傷修復的途徑，臨床醫生和科學工作者長期致力于提高外科技術和改進手術方法，但術后功能恢復仍不如意。近年來飛速發展的組織工程學為此提供了一種新的解決途徑，其中雪旺細胞目前被認為是周圍神經損傷修復中重要的種子細胞，但其很多方面的應用都受到限制。所以，需尋找雪旺細胞的替代細胞。近年來被發現并逐漸成為研究熱點的新型種子細胞之一便是肌源干細胞(muscle- derived stem cell，MDSC)。在本文中作者通過大量閱讀相關文獻，并結合自己的相關實驗經驗，對肌源干細胞誘導分化治療周圍神經損傷的理論依據、實驗方法、新突破及面臨的問題進行綜述。

[關鍵詞]肌源干細胞； 神經營養因子； 雪旺細胞； 周圍神經損傷

周圍神經損傷是因某些因素造成神經軸索中斷或神經斷裂、神經傳導功能障礙，致使軀干及四肢感覺、運動、交感功能障礙的一類臨床病癥。其病理變化為被損傷神經遠端發生Wallerian變性[1]，近端一個或多個郎飛節也發生相似的病理變化，然后雪旺細胞(Schwann cells，SCs)增殖，其在神經膜管內排列有序并形成一條實心的細胞索Bungner帶[2]，同時Bungner帶內有再生的軸突長入，緊接著大多數SCs凋亡，小部分存活的SCs開始與軸突1∶1匹配并包繞軸突形成髓鞘，再生的軸突逐漸延伸至效應器，從而重新建立新的突觸聯系[3]。

1對SCs作用的認識及研究

SCs在周圍神經損傷后的修復中具有重要作用，為周圍神經系統(PNS)特有的神經膠質細胞。成年哺乳動物的中樞神經系統(CNS)損傷后，極少自發地發生結構和功能的再生，主要由于自身的微環境不利于再生，如少突細胞髓鞘套管的存在和膠質瘢痕形成等[4]。而PNS被損傷后可再生，其神經功能也可部分甚至全部恢復，這主要依賴于一個適宜神經再生的微環境，而這個微環境正是由SCs 提供的。據文獻報道，當CNS損傷后，將SCs 移植到其損傷部位可以使CNS再生[5]。因此改造CNS的微環境，使之接近于PNS，目前已成為促進CNS再生的重要策略之一。SCs促進神經再生的機制主要有以下幾方面：(1) 激活免疫反應，具有免疫吞噬作用；(2) 增殖遷移，引導軸突再生；(3) 分泌作用：分泌神經營養因子、細胞外基質分子及細胞黏附分子等；(4) 趨化作用；(5) 神經纖維與 SCs之間形成緊密連接；(6) 形成神經髓鞘等。故將SCs移植到周圍神經內，其可存活，并通過增殖、遷移、分化及分泌多種神經營養因子等促進軸突和髓鞘再生及形成，進而促進修復損傷的周圍神經[6- 9]。

2對肌源干細胞(MDSC)的認識及研究

MDSC是近年來的研究熱點，以往很多文獻均是報道有關于肌衛星細胞和成肌細胞的。Asakura等[10]研究發現肌衛星細胞具有自我更新和成肌、成脂肪、成骨等多向分化的能力，故有“肌肉干細胞”之稱，但其是一種向成肌系細胞定向分化的前體細胞。有文獻[11]報道MDSC是與肌衛星細胞完全不同的一群細胞群,可能是一群原始的干細胞，且未向任何方向分化。研究證實，MDSCs可大量擴增復制，其在體外傳30代后仍可保持其原有的表型特征；在體外進行300次擴增后仍未出現自我復制衰老的征象，依然可以維持較高水平的Sca- 1和CD34表達，但MDSCs的擴增潛能并非是無限的[12]。另外，MDSCs在一般情況下，無誘導因素的作用時，其可定向分化為肌細胞；在特殊的誘導因素刺激下，MDSCs可以分化為心肌細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、軟骨細胞和神經細胞等[13]。Bedair等[14]以小鼠為實驗對象，通過小鼠骨骼肌損傷模型研究證實，MDSCs同時促進受損肌肉及其周圍血管、神經的再生，他們也進一步發現在再生肌組織和體內CD133+/CD34+MDSCs的遷移能力要比SCs更為突出。此外，研究者還發現MDSC缺乏Ⅰ型主要組織相容性復合體(MHC- Ⅰ)，由于MHC- Ⅰ是導致移植組織的排斥反應的重要因素之一，故MDSC具有免疫赦免特性、抗原性極低等特點。正是由于MDSC的這一特性使其異體甚至異種移植成為可能。而作為理想的組織工程種子細胞需要具備的條件有：(1) 可以通過培養擴增等方式大量復制增殖；(2) 具有多向分化的能力，可分化為所需細胞；(3) 具有免疫赦免特性，抗原性低等。由此可見，MDSC完全具備作為理想種子細胞的條件[15- 16]。因此，目前MDSC已被廣泛研究應用于治療壓力性尿失禁、心臟疾病、肌肉障礙疾病、神經損傷等疾病[17- 20]。

3MDSC治療周圍神經損傷的基礎實驗方法

3.1MDSC的分離純化、培養及鑒定

取新生小鼠獲取其純凈的骨骼肌組織，剪碎，應用酶消化法對肌組織進行消化并離心、過濾提取細胞液，然后經改良pre- plating差速貼壁法等方法分離、純化，最后獲得小鼠的原代MDSC，并用臺盼藍染色等方法檢測所提取純化的MDSC的活性，應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態改變和生長狀態，定時更換新鮮培養液[21- 22]；MDSC的鑒定常采用檢測其表面標志物的方法。而MDSC幾乎沒有特異性表面標志物，國內外大部分實驗室聯合檢測Desmin(肌源性標志物)及 Sca- 1(干細胞標志物)對其進行鑒定。Sca- 1是迄今為止研究者們公認的MDSC的表面標志物[23]。Qu- Petersen等[11]研究發現90%的MDSCs表達Sca- 1。另據報道，在MDSCs中Desmin陽性率達90%；而在平滑肌細胞及成纖維細胞中Desmin的陽性率僅15%[24]。有文獻[24]稱，MDSC表面還表達CD13、CD10、CD56等，但其不表達造血細胞表面標志物CD45。

3.2MDSC向SCs誘導及鑒定

取原代提取的MDSC進行鋪板，待其貼壁后更換混有誘導液的培養液，并定期換液，嚴密觀察。細胞有形態學上的變化時，則立即通過多種實驗鑒定技術，如免疫熒光、流式細胞術等對其進行鑒定。目前絕大多數實驗室通過檢測SCs特異性標志物S- 100、GFAP和p75以確定SCs的表型[25- 27]。其中，S100蛋白僅在神經系統膠質細胞高度特異性地表達，主要包括星形膠質細胞(CNS內)和SCs(PNS內)[28]。GFAP是一種分子量為50~52KDa的酸性膠質蛋白，是膠質細胞的標志物之一，當膠質細胞受到各種代謝、物理刺激時其表達增強[29]。p75是神經營養因子的低親和力受體，廣泛分布于神經系統及腫瘤細胞中[30]。

3.3制造鼠周圍神經損傷模型并移植類SCs

選取數只成年健康裸鼠麻醉后暴露一側坐骨神經，做軸突切斷術，切除一定距離的軸突造成神經缺損，并向缺損處注入類SCs，再應用顯微外科縫合線縫合神經外膜。動物清醒后放回動物室單獨飼養。

3.4實驗結果檢測

通過多種直接或間接的實驗檢測技術對術后鼠周圍神經損傷恢復情況進行檢測，并應用統計學軟件對檢測結果進行統計學分析。目前主要的檢測技術有：(1) 步態分析：從行為學角度觀察大鼠觸地/抬起、步長、步頻、速度等，鑒定神經對靶器官的控制能力。(2) 電生理：通過肌電圖、神經電圖、誘發電位觀察周圍神經電恢復情況。(3) 熒光顯微鏡下觀察：Dil標記的MDSCs分布、生長情況。(4) 免疫組織化學：檢測神經特異性蛋白，如S100、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)、M2/M6的表達。(5) 大體及組織學檢測：通過HE染色觀察再生神經組織細胞形態。(6) 熒光鏡逆行示蹤：觀察新生神經軸漿流運輸能力等[31]。

4MDSC治療周圍神經損傷的新研究突破

目前國外內對MDSC誘導分化治療周圍神經損傷尚處于動物實驗的基礎研究階段。最近，國內研究者唐乙等[32]用ELISA等化學方法對小鼠SCs條件培養液進行成分檢測分析，發現小鼠SCs條件培養液中除成纖維細胞生長因子(FGF)、神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)基本檢測不到外，神經生長因子(NGF)、腦源性神經生長因子(BDNF)、神經營養素- 3(NT- 3)、血小板源性生長因(PDGF)、胰島素樣生長因子- 2(IGF- 2)均有不同量的表達。于是他們用以上5種因子單一、兩兩組合、三三組合分別對小鼠的MDSC進行誘導。結果NT- 3、PDGF、IGF- 2組成功誘導其分化為類SCs，并表達了SCs的特征性標志物Sl00、GFAP和p75。在國外，研究者將由人類的骨骼肌提取的MDSC移植到成年裸鼠的坐骨神經缺損處，數周后裸鼠原本喪失運動功能的后肢明顯得到恢復，他們手術暴露原來植入人MDSC的坐骨神經缺損處，發現原來缺損處有了明顯的組織學恢復，而且缺損處再生的神經經鑒定有明顯的朗飛結等結構再生，而且其包含的神經纖維數量與正常的神經基本一致，并且該裸鼠患肢受坐骨神經支配的腓腸肌也沒有出現萎縮[31]。

5結語

盡管目前已有方法成功將MDSC定向誘導分化為類SCs，并且運用人MDSC修復裸鼠的坐骨神經缺損也大獲成功。但如何科學地將類SCs移入具有正常免疫功能的動物活體內促進神經缺損修復，以及如何將來自動物實驗的結果應用到臨床等等還有一系列難題均是國內外研究者還未曾涉獵的，可謂目前的MDSC治療周圍神經損傷的實驗研究突破僅僅為萬里長征剛走完一步，此后還有大量的難題等待著我們科研工作者去竭力探索。但MDSC仍是目前治療周圍神經損傷最有前景的組織工程學材料。相信隨著干細胞生物工程的飛速發展，MDSC應用于臨床治療周圍神經損傷的日子必然為期不遠。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．033

[中圖分類號]R745

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0143- 04

[通信作者]劉建宇E- mail:liujianyu6@hotmail.com

[作者簡介]劉志鑫(1988-)，男，陜西安康人，在讀碩士研究生。E- mail:1025262831@qq.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81272015)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 18

[引文格式] 劉志鑫，張洪雨，劉建宇.肌源干細胞治療周圍神經損傷的研究進展[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：143- 146.

·綜述·