依達拉奉對老年大鼠術后早期記憶水平的影響及其機制研究

羅江輝， 李文瑤，陶國才

(1.四川省腫瘤醫院 麻醉科，四川 成都　610041； 2.第三軍醫大學附屬西南醫院 手術麻醉科，重慶　400038)

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依達拉奉對老年大鼠術后早期記憶水平的影響及其機制研究

羅江輝1， 李文瑤1，陶國才2

(1.四川省腫瘤醫院 麻醉科，四川 成都610041； 2.第三軍醫大學附屬西南醫院 手術麻醉科，重慶400038)

[摘要]目的:探索使用依達拉奉對老年大鼠術后早期記憶水平的影響。方法:將老年大鼠隨機分為空白對照組、手術組和依達拉奉組，依達拉奉組與手術組采用大鼠剖腹探查模型，依達拉奉組于手術結束時肌注依達拉奉3mg·kg-1，對照組不做手術處理。各組大鼠于手術后12、24、72h取靜脈血漿，立即按照S100β試劑盒、神經元特異性烯醇化酶(neuron- specific enolase，NSE )試劑盒說明書測神經損傷特異性標志物S100β蛋白和NSE含量。采用條件恐怖適應實驗中追蹤適應實驗檢測各組大鼠術后記憶能力。各組大鼠于術后72h最后一次采血后斷頭取腦，分離海馬，采用ELISA檢測大鼠海馬IL- 1β、TNF- α濃度。結果:與對照組相比，手術可導致老年大鼠術后血漿S100β蛋白、NSE表達上升(P<0.01)，海馬IL- 1β、TNF- α表達增多(P<0.01)，記憶水平下降(P<0.01)。使用依達拉奉可抑制手術引起的老年大鼠血漿S100β蛋白、NSE表達上升(P<0.01)和海馬IL- 1β、TNF- α表達增多(P<0.01)，減輕手術引起的老年大鼠記憶能力下降(P<0.01)。結論:手術可導致老年大鼠海馬炎癥反應及神經細胞損傷，引發老年大鼠早期記憶水平下降，使用依達拉奉可減輕手術引起的老年大鼠海馬炎癥反應及神經細胞損傷，減輕手術引起的老年大鼠早期記憶水平下降。

[關鍵詞]依達拉奉； 記憶； 炎癥； 手術； 神經細胞； 老年大鼠

術后認知功能障礙(POCD)是臨床常見并發癥，臨床表現為以記憶下降為主的認知功能下降，現在可確定的唯一危險因數為高齡[1]。研究發現圍手術期手術麻醉等各種原因引發的應激反應可以導致中樞炎癥反應，而中樞炎癥反應引發的神經細胞損傷在POCD的發病機制中發揮重要作用[2]。依達拉奉是一種自由基清除劑，具有抗炎癥反應、保護神經細胞的作用[3- 6]。本實驗觀察老年大鼠手術后海馬炎癥反應及神經細胞損傷，同時檢測老年大鼠術后早期記憶水平，旨在發現依達拉奉能否通過其抗炎、保護神經細胞作用，起到預防POCD發病的作用。

1材料和方法

1.1材料

實驗動物使用第三軍醫大學動物實驗中心提供的18~20月齡雄性SD大鼠。

1.2實驗動物分組及模型制備[7]

實驗動物分為空白對照(C)組、手術(S)組、依達拉奉處理(E)組，每組12只。C組大鼠不進行手術，肌肉注射生理鹽水1ml·kg-1以模擬抓拿及注射刺激。使用5%水合氯醛(4~6ml·kg-1)給S組及E組老年大鼠麻醉。老年大鼠達到夾尾實驗陰性的麻醉深度后，消毒腹部皮膚，取正中切口，長約2cm，止血后依次探查腹腔器官，每5min探查1次，每次約1min，共探查6次后依次縫合腹腔。手術共進行約40min。手術結束時，E組老年大鼠肌注依達拉奉3mg·kg-1(3mg·ml-1)[8]。

1.3條件恐怖適應實驗[7]

使用條件恐怖適應實驗中追蹤適應實驗檢測大鼠術后早期記憶。實驗于手術前3d開始，訓練房間與記錄房間隔開，將大鼠單只置于訓練房電擊籠內，由揚聲器發出16s噪聲，在噪聲持續的最后2s內加以1mA電擊老年大鼠足底。12s后進行第二次訓練，每只大鼠每日進行10次訓練。共進行3d。3d后S組及E組大鼠進行剖腹探查手術，C組給予肌肉注射生理鹽水1ml·kg-1。術后24h各組大鼠依次單只置于電擊籠內，只使用噪音，不使用電擊，記錄大鼠僵直時間占總時間百分比。電腦軟件(bio- will～，上海軟隆)分析僵直時間占總時間百分比。

1.4S100β蛋白、NSE含量檢測

3組大鼠于術后12、24、72h使用尾靜脈采靜脈血漿，使用S100β蛋白、NSE檢測試劑盒進行血漿S100β蛋白、NSE含量檢測，嚴格按說明書進行。

1.5IL- 1β、TNF-α含量檢測

3組大鼠于術后72h最后一次取血后斷頭取腦，分離海馬，將海馬勻漿，使用ELISA試劑盒檢測海馬組織IL- 1β、TNF-α含量，嚴格按說明書進行。

1.6統計學處理

2結果

2.1條件恐怖適應實驗

2.1.1在無任何刺激環境中老年大鼠僵直時間占總時間比C組老年大鼠在無任何刺激環境中的僵直時間占總時間比為(6.12±1.1)%，S組老年大鼠在無任何刺激環境中的僵直時間占總時間比為(6.12±1.2)%，E組老年大鼠在無任何刺激環境中的僵直時間占總時間比為(6.11±1.4)%，3組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.2老年大鼠僵直時間占總時間比剖腹探查手術后24h， C組老年大鼠僵直時間占總時間比為(941.6±4.3)%，S組老年大鼠僵直時間占總時間比為(7.83±0.9)%，E組老年大鼠僵直時間占總時間比為(28.52±2.9)%。S組老年大鼠與C組比較，僵直時間占總時間比明顯減少，表明老年大鼠手術后后記憶水平下降(P< 0. 01)。E組老年大鼠僵直時間占總時間比相比S組明顯上升，表明E組老年大鼠相比手術組老年大鼠記憶水平改善(P< 0.01)。

2.2老年大鼠術后靜脈血漿神經損傷標志物檢測結果

手術后12、24、72h，S組、E組大鼠血漿神經損傷標志物S100β蛋白、NSE表達都較C組高，差異有統計學意義(P<0.01)；E組表達較S組低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。說明手術可損傷神經細胞，使用依達拉奉可降低手術對神經細胞的損傷。

組 別S100β/ng·L-1NSE/ng·L-1術后12h術后24h術后72h術后12h術后24h術后72hC組0.34±0.010.35±0.030.34±0.03209.62±31.01212.22±30.69210.31±31.82S組1.29±0.13a1.39±0.11a0.89±0.14a454.42±47.93a416.91±32.15a290.76±32.87aE組0.85±0.13ab0.67±0.19ab0.52±0.11ab339.11±51.41ab329.32±43.41ab238.6±32.92ab

與C組比較，aP<0.01；與S組比較，bP<0.01

2.3老年大鼠海馬炎癥因子表達結果

術后72h，S組、E組老年大鼠海馬TNF-α和IL- 1β蛋白表達都較C組高，差異有統計學意義(P<0.01)；E組表達較S組低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。說明手術可引發老年大鼠中樞海馬炎癥反應，使用依達拉奉可減輕手術引發的老年大鼠中樞海馬炎癥反應。

ng·L-1

與C組比較，aP<0.01;與S組比較，bP<0.01

3討論

POCD主要發生于老年人，發病率較高[1，9]。 據國際術后認知功能障礙協會一項大樣本、多中心報道，65歲以上老年人術后1周POCD發病率約為25.8%，3個月后發病率為9.9%[1]。POCD發病機制不清，發病原因不明[3]。目前研究發現炎癥反應是POCD發病機制研究，特別是早期POCD發病研究的中心環節，可引發神經細胞損傷及凋亡[5]。中樞炎癥反應時，TNF-α和IL- 1β釋放增加，吸引中性粒細胞聚集，激活免疫細胞和內皮細胞產生多種細胞因子，誘導炎癥細胞因子的基因表達及分泌，促進神經毒性物質的產生和釋放[10- 11]。本實驗發現手術應激后3d，老年大鼠海馬TNF-α和IL- 1β釋放增加，說明手術應激早期可引發老年大鼠中樞炎癥反應。

當神經細胞和神經膠質膜受損時，NSE和S100β蛋白可釋放至細胞外間隙，通過受損的血腦屏障進入腦脊液和血液，因而測定其變化可以反映中樞神經損傷。腦脊液中NSE和S100β蛋白的變化與患者的年齡、性別有關，而血液中的變化與年齡、性別無關。S100β蛋白、NSE是目前常用檢測腦損傷及腦功能損傷指標[12- 13]。本實驗發現，術后12、24、72h，手術組大鼠NSE和S100β蛋白表達都上升，說明手術應激早期可造成神經細胞損傷。

條件恐怖適應實驗是目前國際上常用的檢測記憶水平的實驗工具[7]，由于其不受運動能力影響，因而適合術后檢測大鼠記憶水平。條件恐怖適應實驗分兩種，分別為追蹤適應以及延遲適應，追蹤適應主要與海馬記憶相關，而延遲適應主要與杏仁核相關[10]。本實驗采用追蹤適應實驗檢測大鼠海馬記憶，結果發現術后24h大鼠僵直時間明顯低于對照組，說明手術損傷了老年大鼠早期記憶水平。

依達拉奉作為一種強自由基清除劑，具有抗炎癥反應、保護神經細胞的作用，目前已用于急性腦損傷、腦梗死、腦出血等多種神經系統疾病治療[3- 6]。但依達拉奉是否可通過其抗炎、保護神經細胞作用預防早期POCD發病，目前研究甚少。本實驗發現老年大鼠術后使用依達拉奉較不使用依達拉奉可降低其術后早期血漿神經細胞損傷標志物NSE和S100β蛋白表達，減輕其海馬炎癥反應，同時改善其術后24h記憶水平，說明依達拉奉可能通過抗炎、保護神經細胞作用起到預防老年大鼠早期POCD發病作用。

綜上所述，依達拉奉可能具有通過抑制中樞炎癥反應保護神經細胞、預防早期POCD發病的作用，值得進一步研究。

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Effects of edaravone on early memory of rats with its mechanism research

LUO Jiang- hui1，LI Wen- yao1，TAO Guo- cai2

(1.DepartmentofAnesthesiology，SichuanCancerHospital，Chengdu610041，China; 2.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SouthwestHospital，theThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of edaravone on early memory of rats and its mechanonism. Methods: Aged rats were randomly allocated to the following contral(C)group， abdominal surgery alone(S)group， or intramuscular injection of edaravone after surgery(E)group. Rats received abdominal surgery in S group and E group. Rats in E group received intraperitoneally injection of edaravone (3mg·kg-1) after abdominal surgery. The concentration of S100β and NSE in plasma were measured by ELISA 12，24，72h after operation. Hippocampal IL- 1β，TNF- α were measured by ELISA 72h after operation.Rats’ memory was assessed by Fear Conditioning Test 24h after surgery. Results: Compared with that of control group， the concentration of S100β and NSE in plasma enhanced after surgery (P<0.01)but diminished if using edaravone(3mg·kg-1) (P<0.01).Compared with that of control group， the expression of IL- 1β，TNF- α in rats’ hippocampa enhanced after surgery (P<0.01)but diminished if using edaravone (3mg·kg-1) (P<0.01). Surgery could result in rats’ memory impairment(P<0.01)but diminished if using edaravone (3mg·kg-1) (P<0.01). Conclusion: Edaravone can restrain central inflamaton and injury of nerve to diminish the memory impairment after surgery in rats．

[Key words]edaravone; memory; inflammation; surgery; nerve cells； old rats

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.020

[中圖分類號]R96; R656

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0088- 04

[通信作者]陶國才E- mail:13908393339@vip.163.com

[作者簡介]羅江輝(1972-)，男，四川瀘州人，主治醫師。 E- mail:temasek@qq.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81171034)

[收稿日期]2015- 06- 22[修回日期] 2015- 11- 22

[引文格式] 羅江輝，李文瑤，陶國才.依達拉奉對老年大鼠術后早期記憶水平的影響及其機制研究[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：88- 91.

·論著·