熄風湯對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響

朱會杰，曹林，唐波，郭凱

(1.南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京　210095； 2.南京諾唯贊生物科技有限公司，江蘇 南京　210000；

3.中國中醫科學院 望京醫院，北京　100102)

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熄風湯對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響

朱會杰1，曹林1，唐波2，郭凱3

(1.南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京210095； 2.南京諾唯贊生物科技有限公司，江蘇 南京210000；

3.中國中醫科學院 望京醫院，北京100102)

[摘要]目的：觀察10ml·kg-1的給予劑量、限時2周的熄風湯灌胃對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響。方法：30只小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、模型組、熄風湯治療組，每組10只。前兩組小鼠進行10 ml·kg-1生理鹽水灌胃，熄風湯治療組同時間等劑量進行熄風湯復方灌胃，連續2周后模型組和熄風湯治療組小鼠腹腔注射30mg·kg-11- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶(1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine， MPTP)，1次·d-1，連續7d，對照組予同等體積的生理鹽水注射。3d后進行行為學檢測，免疫印跡和免疫組化檢測酪氨酸羥化酶蛋白水平及其陽性神經元數目。結果：行為學檢測結果顯示，熄風湯治療組小鼠懸尾和強迫游泳靜止率較模型組明顯降低(P<0.05),酪氨酸輕化酶蛋白水平及其陽性神經元細胞數顯著增加(P<0.05)。結論：在上述條件下，熄風湯有助于改善MPTP致帕金森病模型小鼠的癥狀，對小鼠腦內多巴胺能神經元具有一定的保護的作用。

[關鍵詞]熄風湯； 1- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶； 酪氨酸羥化酶； 多巴胺能神經元； 帕金森病； 小鼠

帕金森病(Parkinson’s disease， PD)是人類常見的神經退行性疾病之一，以靜止性震顫、肌強直、運動障礙為突出癥狀。一項涉及全球20多個國家PD患者流行性病學的研究數據分析表明，我國發病率為1.9/10萬，歐美國家為9.4/10萬[1]。隨著社會進入老齡化階段，PD的發病率無疑逐步增加。盡管人類認識PD已經200多年了，但至今PD的發病機制仍是謎團，研究表明，多個因素參與了PD的發病機制，包括環境因素、線粒體功能障礙與氧化應激、自噬、神經炎癥反應等[2]。PD的發病基礎為黑質致密部(substantia nigra compacta， SNC)內的多巴胺能(dopaminergic， DA)神經元丟失，殘存神經元出現α- 突觸核蛋白(α- synuclein，α- SYN)和路易小體(Lewy Bodys， LBs)，DA釋放減少[3]。α- SYN的調控作用主要表現在通過作用于酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase， TH)調節多巴胺合成[4]。DA神經元通過攝取血液中的酪氨酸，經胞質內TH催化形成多巴，多巴由多巴脫氫酶催化生成多巴胺，因此TH的活性和表達的變化會直接影響多巴胺的生物合成，其數量的多寡直接反映DA神經元凋亡的嚴重程度。多年來，對PD的治療主要基于藥物治療和外科手術治療[5]，如左旋多巴胺、抗膽堿藥、單胺氧化酶抑制劑、神經保護劑、腦深部刺激等，但無論哪種藥物都只能減輕臨床癥狀而不能阻止疾病的發展，長期使用還會出現不良反應[6]。

熄風湯是一種治療PD療效較為理想的經驗處方，由柴胡、懷牛膝、白芍、鉤藤、黨參、山藥、知母、桔梗、生甘草組成，臨床觀察到該方劑能夠有效改善PD患者患側肢體的靜止性震顫、肢體痙攣疼痛、睡眠障礙等癥狀，并延緩或有效逆轉PD的疾病進程。本研究以1- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶(1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine， MPTP)構建PD模型小鼠為平臺，觀察熄風湯治療2周后其行為學特征、黑質DA神經元的變化，為進一步探討熄風湯防治PD打下基礎。

1材料與方法

1.1動物及試劑

8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠30只，體重20~25g，購自北京華阜康生物科技有限公司，自由進食飲水，室溫20~25℃，濕度45%~65%，光照和黑暗交替各12h的環境下適應性飼養1周。試劑：MPTP (Sigma 公司)，TH一抗 (Mlillipore 公司)，BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，熄風湯復方(中國中醫科學院望京醫院)。

1.2熄風湯復方制備

取一定比例的柴胡、懷牛膝、白芍、鉤藤、黨參、山藥、知母、桔梗、生甘草，水煎煮，得浸膏，浸膏濃縮到60℃時比重為1.10~1.20，存于4℃冰箱備用，使用時采用蒸餾水溶解，混懸至生藥2.0g·ml-1，待灌胃用。

1.3PD模型的制備與分組

實驗動物在動物房安靜環境下飼養1周后隨機分為3組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、熄風湯治療組。前兩組小鼠10 ml·kg-1生理鹽水灌胃，熄風湯治療組同時間等劑量熄風湯復方灌胃，連續2周后，模型組和熄風湯治療組小鼠分別腹腔注射MPTP 30mg·kg-1(生理鹽水溶解)，1次·d-1，連續7d，正常對照組予同等體積的生理鹽水注射，之后進行行為學測定。

1.4行為學檢測

模型制備完成第3天進行行為學檢測。懸尾實驗：基于Steru等[7]建立的方法，用醫用膠帶綁住小鼠尾末端部，使其頭部向下懸掛于水平橫桿上，其表現為不動狀態反映其行為絕望，利用安徽正華公司的懸尾實驗視頻分析系統記錄6min內2~6min靜止不動時間占總時間的比率，比率越高，絕望程度越強。強迫游泳實驗與懸尾類似：將小鼠放入一個直徑25cm、高度40cm、水深20cm、水溫25℃的透明樹脂玻璃水缸內，利用安徽正華公司的強迫游泳實驗視頻分析系統記錄6min內2~6min漂浮不動的時間占總時間的比率，比率越高，體能越差，反映其絕望程度越高。

1.5Western Blotting檢測

小鼠進行快速斷頭取腦，取小鼠中腦黑質部位，勻漿，提取總蛋白，BCA蛋白定量，取一半樣品加入上樣緩沖液水浴煮沸5min備用。取20μg蛋白樣品進行12% SDS- PAGE凝膠電泳后，轉膜儀轉至硝酸纖維素(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉1h，加入小鼠抗 TH 單克隆抗體(1∶1000)(β- Actin為內參)，4℃過夜，經PBST漂洗后與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，ECL顯影液化學發光顯色，使用光密度分析軟件進行目的條帶檢測及分析。

1.6免疫組化檢測

實驗小鼠用乙醚麻醉后開胸暴露心臟，剪開右心葉放血，從心尖插入灌注針到左心室，生理鹽水灌注直至肝臟發白、體內流出液體為無色，換用4℃ 4%多聚甲醛(paraformaldehyde， PFA)固定至小鼠尾巴彎曲、四肢僵硬，停止灌注。完整取腦，4% PFA后固定1h，15%、20%、30%蔗糖梯度脫水，OCT包埋劑包埋及連續腦組織冠狀切片，37℃烘箱烘片，5% BSA加0.5% Triton X- 100 0.01mol·L-1PBS封閉，室溫1h，滴加小鼠抗 TH 單克隆抗體(1∶500)，4℃過夜，PBS沖洗，加入熒光二抗(1∶500)，PBS沖洗，DAPI復染，封片，熒光顯微鏡觀察，每組每只動物取2張黑質部腦片，隨機取6個高倍視野，進行黑質TH陽性神經元計數。

2結果

2.1行為學檢測結果

模型組小鼠于第1 次注射 MPTP 后0.5~1 h 均出現不同程度的震顫、豎毛、翹尾等表現；最后1次注射后，小鼠出現動作減少、倦臥、尾僵直、細小震顫等癥狀。熄風湯治療組小鼠第1次注射 MPTP 后出現輕微的震顫、豎毛表現；最后1次注射后，小鼠尾僵直的頻率、時間較模型組有所改善。懸尾實驗和強迫游泳實驗是將小鼠置于無逃避的應激狀態下，其表現為不動狀態反映了其行為絕望，可模擬人類的PD癥狀，與正常小鼠相比，模型組懸尾、強迫游泳的靜止率均顯著高于正常對照組(P<0.01)，反映了其激惹程度小于正常組，說明造模成功。熄風湯治療組懸尾、強迫游泳靜止率均顯著低于模型組(P<0.05)(表1)，說明熄風湯治療在一定程度上改善了PD小鼠的乏力程度。

表1各組行為學評分比較

Tab 1Behavioral scores in each group

%

與正常對照組相比，aP<0.05， bP<0.01；與模型組相比, cP<0.05

2.2Western blotting檢測結果

我們利用Western blotting的方法在PD小鼠模型中檢測了TH蛋白的表達變化。結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠中腦黑質內TH蛋白水平明顯下降，熄風湯治療后MPTP 誘發的TH蛋白表達水平的下降得到明顯抑制(圖1A)。再對蛋白表達量進行檢測，并對TH蛋白與內參蛋白β- Actin的灰度比值進行統計分析，模型組TH蛋白表達較正常組顯著降低(0.389±0.0356vs0.8096±0.0172，P<0.01)，熄風湯治療組TH蛋白水平較模型組顯著上升(0.5511±0.0484vs0.389±0.0356，P<0.05)，說明熄風湯對PD小鼠黑質TH蛋白具有保護作用(圖1B)。

A.Western Blotting檢測TH 表達的變化； B.TH的相對灰度值統計分析；與正常對照組相比, aP<0.05， bP<0.01;與模型組相比, cP<0.05

圖1不同處理組中小鼠黑質TH的表達變化(n=3)

Fig 1The expression of mice substatia nigra TH in different treatment groups (n=3)

2.3免疫組化檢測結果

為了進一步驗證熄風湯對MPTP 誘導的黑質DA神經元丟失具有保護作用，我們應用免疫熒光組織化學方法分別檢測了不同組小鼠黑質 TH陽性神經元的數目。與正常對照組相比，模型組TH陽性神經元呈帶狀分布僅存輪廓，陽性纖維、細胞稀疏，排列紊亂，胞體面積變小，胞漿染色變淡，突起細短、稀疏。熄風湯治療后，TH陽性神經元表達密集，細胞濃密，排列整齊。見圖2。

圖2不同處理組小鼠TH神經元存活狀態(n=6,×50)

Fig 2TH neurons suevival status in different treatment groups(n=6,×50)

進一步在200倍熒光顯微鏡視野下，神經元排列更清楚地呈現在我們面前，與正常對照組小鼠相比，模型組中小鼠黑質DA神經元顯著減少，熄風湯治療組小鼠黑質的TH 陽性神經元數量明顯增加，見圖3。經統計分析，模型組與正常對照組相比，TH陽性神經元數目顯著下降(66.4±8.5vs33±6.12，P<0.01)，熄風湯治療后TH陽性神經元數目增加了近40%(45.6±5.59vs33±6.12，P<0.05)，見圖4。

3討論

PD是一種以中腦黑質DA神經元變性壞死為特征性病理變化的神經系統退行性疾病，其主要病理表現為大腦黑質神經遞質多巴胺含量大幅度下降，導致另一神經遞質乙酰膽堿相對增加，從而引發一系列的靜止性震顫、肌強直、運動減少等癥狀[8]。DA神經細胞的變性是 PD 發病的中心環節，PD 病因、發病機制復雜，目前尚不完全明確。到目前為止國內外已建立了眾多的動物模型來研究PD，其中應用最為廣泛的是MPTP小鼠模型[9]。MPTP具有親脂性，很容易進入腦內，MPTP穿過血腦屏障后被單胺氧化酶B(monoamine oxidase- B， MAO- B)轉化為相應的二氫吡啶，隨之氧化為1- 甲基- 4- 苯基吡啶(1- methyl- 4- phenylpyridinium， MPP+)， MPP+通過DA運轉體進入紋狀體DA神經元內，可抑制TH的活性從而減少多巴胺的合成[9]。正是基于MPTP選擇性作用于SN DA神經元并引起多巴胺大幅度減少這一特性，用MPTP制備PD動物模型可模仿人類PD的臨床和病理性特征，從而用于該病的發病機制和治療方案的研究[11]。由于MPTP在小鼠體內具有級聯放大作用，故一般在模型制備完成第3天檢測造模是否成功。

PD的典型癥狀就是運動機能受損和大腦多巴胺水平的下降[12]，因此本實驗采用熄風湯灌胃干預MPTP致PD小鼠模型，檢測行為學及TH含量變化，研究表明，模型組小鼠行為學明顯減少，TH蛋白及陽性神經元顯著降低，證實了小鼠 PD 模型行為學變化與TH神經元前后形態學改變、表達含量的變化密切相關，具有一致性[13]。本研究證實：(1) 行為學結果提示熄風湯治療組小鼠的行為學癥狀較模型組有顯著改善；(2) 免疫印跡和免疫組化結果提示熄風湯治療組小鼠黑質TH蛋白及陽性神經元均較模型組有顯著改善，說明熄風湯能保護由MPTP所誘導的DA神經元的降低。

圖3不同處理組小鼠TH神經元存活狀態(n=6，×200)

Fig 3TH neurons survival status in different treatment groups(n=6，×200)

與正常對照組相比, aP<0.05， bP<0.01; 與模型組相比, cP<0.05

圖4不同處理組TH神經元數目變化(n=6，×200)

Fig 4TH neurons number changes in different treatment groups(n=6,×200)

熄風湯的保護機制目前還不清楚，可能與下列因素有關：在熄風湯復方中，柴胡歸肝膽經，具有疏肝解郁的作用；懷牛膝引血下行，折其陽亢，并能滋養肝腎；白芍具有柔肝養血和平肝斂陰的作用；鉤藤具有清熱平肝、熄風鎮痙的作用。現代藥理證明白芍、鉤藤均具有抗驚厥、鎮靜、解痙的作用，黨參、山藥具有補脾益氣的作用，知母具有清虛熱生津作用，能有效改善PD患者陰虛潮熱的癥狀；桔梗宣肺利氣，通調水道，又能載藥上行；甘草調和諸藥。全方共奏滋補肝腎、平肝熄風之功，有效改善了PD小鼠的癥狀。

盡管熄風湯神經保護效應的具體機制尚未闡明，但本研究結果可以提示：10ml·kg-1的熄風湯限時兩周的灌胃，對PD模型小鼠黑質DA神經元具有保護作用，為今后深入探討熄風湯治療PD提供了新的思路及實驗依據。

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Influence of Xifengtang on the dopaminergic neurons of Parkinson model mice

ZHU Hui- jie1，CAO Lin1，TANG Bo2，GUO Kai3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China;2.NanjingVazymeBiologicalTechnologyCo.LTD，Nanjing210000，China; 3.WangjingHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100102,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of Xifengtang on the dopaminergic neurons of Parkinson model mice under the conditions of oral administered 10 ml·kg-1body weight dose in two weeks time limit. Methods: 30 mice were randomly assigned into three groups: normal control group， model group and Xifengtang- treated group. The first two groups received 10 ml·kg-1saline and Xifengtang- treated group received the same vomule Xifengtang once a day for 2 weeks. Then the model group and the Xifengtang- treated group were intraperitoneally injected with 30 mg·kg-1MPTP once a day for continuously 7 days， and the same volume saline in normal control group. Three days later， behavioral parameters were recorded and tyrosine hydroxylase level was examined by Western blotting and immunohistochemistry. Results: Xifengtang-treated group showed significantly better performance than the other two groups in the tail suspension and forced swimming tests (P<0.05). Also， the TH levels and the number of TH- positive dopaminergic neurons were significantly higher in Xifengtang- treated group(P<0.05). Conclusions: Under the above conditions， Xifengtang can improve the symptoms of mouse with MPTP- induced Parkinson’s disease. Dopaminergic neurons is also being protected from this degenerative process.

[Key words]Xifengtang; 1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine; tyrosine hydroxylase; dopaminergic neurons； Parkinson’s disease； mice

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.003

[中圖分類號]R742.5; R285.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0011- 06

[通信作者]曹林E- mail:caolin@njau.edu.cn

[作者簡介]朱會杰(1988-)，女，河南周口人，在讀碩士研究生。E- mail:zhuhuijie123@163.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(31101223)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 12

[引文格式] 朱會杰，曹林，唐波，等.熄風湯對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：11- 16.

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