IL- 1β通過p38、JNK和NF- κB信號通路促進髓核細胞增殖

王小虎，吳小濤

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京　210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科中心，江蘇 南京　210009)

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IL- 1β通過p38、JNK和NF-κB信號通路促進髓核細胞增殖

王小虎1,2，吳小濤1,2

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科中心，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：探討白細胞介素1β(IL- 1β)對髓核細胞增殖的影響，并深入研究其機制。方法：體外培養人髓核細胞，用IL- 1β處理髓核細胞，通過CCK- 8實驗和Ki67免疫熒光實驗檢測IL- 1β對髓核細胞增殖能力的影響。用Western blotting檢測IL- 1β對MAPK和NF- κB信號通路的影響。通過對細胞信號通路進行特異性抑制，觀察上述通路在IL- 1β作用于髓核細胞過程中的作用。結果：CCK- 8實驗和Ki67免疫熒光實驗均提示IL- 1β提高髓核細胞的增殖能力。Western blotting實驗顯示IL- 1β顯著激活髓核細胞中的MAPK和NF- κB信號通路。使用p38、JNK和NF- κB的抑制劑均能明顯抑制 IL- 1β誘導的髓核細胞增殖，而ERK的抑制劑則不能。結論：IL- 1β通過p38、JNK和NF- κB信號通路促進髓核細胞增殖。

[關鍵詞]白細胞介素1β； 髓核細胞； 增殖； MAPK； NF- κB

腰痛是骨科最常見的臨床癥狀之一，約80%的人在其一生中都會受到腰痛的困擾[1]。腰痛不僅給個人、家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔，而且還嚴重影響了患者的生活質量[2]。椎間盤退變被認為是引起腰痛的最重要原因[3]。多位學者證實，在椎間盤退變過程中，椎間盤細胞密度隨著椎間盤退變程度的升高而增高[4- 6]。與此同時，退變椎間盤內細胞改變原有均勻的生長方式，轉為團簇狀聚集生長。Johnson等[7]報道在人退變椎間盤中常常能發現增殖中的細胞，特別是在成簇生長的細胞當中。退變椎間盤內常常出現細胞增殖能力升高，以致于后者已被作為椎間盤退變的一種標志物[8- 9]。隨著椎間盤退變，多種炎癥因子的表達顯著增加。其中，白細胞介素1β(interleukin 1β，IL- 1β)被認為是調控椎間盤退變的最主要的炎癥因子[10]。大量文獻報道IL- 1β能促進包括腎上腺皮質細胞[11]、平滑肌細胞[12]、關節軟骨細胞[13]等多種細胞的增殖。然而對于髓核細胞，IL- 1β是否能促進其增殖尚無定論。本研究在體外培養人髓核細胞，探討IL- 1β是否影響髓核細胞的增殖，為了解椎間盤退變過程中髓核細胞的生長、增殖狀況奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

人髓核細胞和髓核細胞培養基購自美國ScienCell公司。重組人IL- 1β購自美國Peprotech公司。Cell Counting Kit- 8 (CCK- 8)試劑盒購自日本Dojindo公司。兔抗人Ki67抗體購自英國Abcam公司。Alexa Fluor 594驢抗兔IgG抗體購自美國Molecular Probes公司。抗磷酸化p65(P- p65)、p65、P- p38、p38、P- ERK、ERK、P- JNK、JNK、HRP標記的抗兔IgG二抗和U0126均購自美國CST公司。SP60025、SB203580和pyrrolidinedithiocarbamate ammonium(PDTC)均購自英國Tocris公司。

1.2方法

1.2.1髓核細胞培養人髓核細胞用含2%胎牛血清、1%髓核細胞生長添加劑和1%青霉素/鏈霉素溶液的髓核細胞專用培養基，于體積分數5%的CO2中37 ℃下進行培養。第5代細胞用于實驗。

1.2.2CCK- 8實驗將髓核細胞按照3 500個·孔-1接種于96孔板。待細胞貼壁后，向培養基中加入IL- 1β(0.1、1、10 ng·ml-1)，繼續培養48 h。然后棄去培養板中原有培養基，在每孔中加入100 μl新鮮培養基和10 μl CCK- 8試劑，繼續培養4 h后于酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值。為了檢測信號通路的作用，我們將信號通路抑制劑預處理髓核細胞后，再加入IL- 1β作用細胞。細胞增殖率=(實驗組吸光度-空白孔吸光度)/(對照組吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.2.3Ki67免疫熒光實驗將髓核細胞接種于細胞爬片上。細胞貼壁后，實驗組加入IL- 1β(10 ng·ml-1)，繼續培養24 h后用PBS洗滌3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定25 min。將多聚甲醛洗凈后加入0.2% Triton X- 100破膜15 min，然后置于5%BSA中室溫封閉1 h。隨后用兔抗人Ki67抗體4 ℃孵育過夜。PBS洗滌5次后加入驢抗兔熒光二抗，室溫孵育2 h。PBS洗滌后加入DAPI于37 ℃下孵育2 min。PBS洗滌5次后甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。

1.2.4Western blotting實驗實驗組加入IL- 1β處理15 min后，提取各組細胞總蛋白。將蛋白樣品通過10% SDS- PAGE電泳分離后，恒流(250 mA)轉PVDF膜1 h，用5% BSA/TBST封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次×5 min，加入HRP標記的抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次×5 min，ECL顯色拍照。

1.3統計學處理

應用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析和t檢驗對結果進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1IL- 1β促進髓核細胞增殖

我們首先用CCK- 8實驗對細胞增殖進行分析，研究IL- 1β是否促進髓核細胞增殖。如圖1，IL- 1β在濃度為0.1 ng·ml-1時即能顯著促進髓核細胞增殖(P<0.01)。在0.1~10 ng·ml-1的濃度范圍內，IL- 1β均能促進髓核細胞增殖(P< 0.01)，且呈濃度依賴性。

為了進一步確定IL- 1β對髓核細胞增殖的影響，我們進行了細胞增殖標志物Ki67的免疫熒光實驗。如圖2，IL- 1β處理組的Ki67陽性率顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2IL- 1β激活髓核細胞中MAPK和NF-κB信號通路

為了深入研究IL- 1β誘導髓核細胞增殖的機制，我們先用Western blotting實驗觀察IL- 1β是否激活髓核細胞中的MAPK和NF-κB信號通路。如圖3，IL- 1β作用髓核細胞15 min后，p38、ERK、JNK和p65均發生顯著的磷酸化。

與對照組相比，aP<0.01

圖1IL- 1β對人髓核細胞增殖的影響

Fig 1Effect of IL- 1βon proliferation of human nucleus pulposus cells

A.IL- 1β對髓核細胞表達Ki67的影響； B.統計結果,與對照組比較，aP<0.05

圖2IL- 1β上調髓核細胞中Ki67的表達

Fig 2IL- 1βupregulates the expression of Ki67 in human nucleus pulposus cells

2.3IL- 1β通過激活p38、JNK和NF-κB信號通路誘導髓核細胞增殖

為了探討MAPK和NF-κB信號通路在IL- 1β誘導髓核細胞增殖中發揮怎樣的作用，我們用不同的抑制劑分別預處理髓核細胞，隨后加入IL- 1β作用48 h后用CCK- 8檢測細胞增殖。如圖4，p38的抑制劑SB203580、JNK的抑制劑SP60025和NF-κB的抑制劑PDTC均能顯著抑制 IL- 1β誘導的髓核細胞增殖(P< 0.01)，而ERK的抑制劑U0126則不能(P>0.05)。

圖3IL- 1β激活MAPK和NF-κB信號通路

Fig 3IL- 1βactivates MAPK and NF-κB signaling pathways

1組：未處理組；2組：單純IL- 1β處理組；3組：p38抑制劑SB203580預處理組；4組：ERK抑制劑U0126預處理組；5組：JNK抑制劑SP60025預處理組；6組：NF-κB抑制劑PDTC預處理組；與單純IL- 1β組(2組)相比，aP<0.01

圖4信號通路抑制劑對IL- 1β誘導的髓核細胞增殖的影響

Fig 4Effect of signaling pathway inhibitors on IL- 1βinduction of nucleus pulposus cell proliferation

3討論

椎間盤退變是多因素共同參與的復雜的慢性過程[14]。其中，炎癥因子發揮了重要作用[15]。le Maitre等[16]通過比較正常椎間盤和退變椎間盤，發現在退變椎間盤中顯著高表達IL- 1β。IL- 1β是一種強有力的促炎癥因子。在椎間盤退變過程中，IL- 1β扮演了極為重要的角色[10]。IL- 1β不僅能刺激髓核細胞產生其他細胞因子，如IL- 6、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等[17]，還能上調基質降解酶的表達和活性，加速細胞外基質的降解[17- 19]。除此之外，IL- 1β還能抑制蛋白多糖和二型膠原的合成，加重椎間盤退變[16]。因此，IL- 1β通過改變髓核細胞的分泌表型調控了椎間盤退變的發生和發展過程。然而，IL- 1β是否會影響髓核細胞的增殖目前尚不明確。一些學者認為IL- 1β誘導髓核細胞凋亡[20- 22]，從而導致椎間盤內髓核細胞數量的減少，進一步加重椎間盤退變。但最近的一項研究發現IL- 1β不僅不會抑制髓核細胞的增殖，而且還顯著激活與細胞增殖關系密切的NOTCH信號通路[23]。

在動脈粥樣硬化、慢性肝炎、慢性腎炎等炎癥相關性疾病中，局部組織高表達多種炎癥因子，構成了一個炎性微環境。在這種微環境下，炎癥因子刺激相關細胞異常增殖，在疾病的病理生理過程中發揮了重要的作用。在退變的椎間盤中，同樣高表達IL- 1β、TNF-α等炎癥因子，也存在炎癥因子的微環境。在這種炎性微環境的刺激下，髓核細胞是否也會出現異常的增殖呢？我們早期的研究已經證實，在短期刺激下，TNF-α能促進髓核細胞增殖[24]。為了探討IL- 1β是否能誘導髓核細胞增殖，本研究首先通過CCK- 8實驗，證實在0.1~10 ng·ml-1的濃度范圍內，IL- 1β能促進髓核細胞增殖，且具有濃度依賴性。為了進一步確定IL- 1β對髓核細胞的促增殖作用，我們進行了Ki67免疫熒光實驗。Ki67是一種公認的細胞增殖標志物。我們的結果顯示，10 ng·ml-1的IL- 1β顯著提高了髓核細胞的Ki67表達陽性率。這些結果提示我們短期的IL- 1β刺激促進髓核細胞的增殖。

文獻報道MAPK和NF-κB是調控椎間盤退變的關鍵信號通路[19，25]。而且，MAPK和NF-κB也是調控細胞生長增殖的重要信號通路。在本研究中，我們發現IL- 1β作用髓核細胞15 min后，p38、ERK、JNK和p65均發生顯著的磷酸化，表明上述通路被IL- 1β激活，與以往文獻報道一致。CCK- 8實驗結果顯示p38、JNK和NF-κB信號通路的抑制劑均能在不同程度上抑制IL- 1β誘導的髓核細胞增殖，而ERK的抑制劑無效。這些結果提示在IL- 1β促進髓核細胞增殖的過程中，p38、JNK和NF-κB信號通路在其中發揮了重要的作用。

綜上所述，本研究在體外初步證實IL- 1β通過激活p38、JNK和NF-κB信號通路促進了髓核細胞增殖，為全面了解髓核細胞在椎間盤內炎癥微環境下的生存、增殖狀況奠定了基礎。與正常椎間盤中髓核細胞均勻生長不同，退變椎間盤中的髓核細胞呈團簇狀生長。這種生長方式的改變與炎癥因子誘導髓核細胞異常增殖是否緊密相關，以及它們與椎間盤退變的關系，均有待進一步的研究。

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IL- 1βpromotes the proliferation of human nucleus pulposus cells via p38，JNK and NF-κB

WANG Xiao- hu1,2，WU Xiao- tao1,2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.SpineCenter，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of IL- 1β on proliferation of human nucleus pulposus(NP) cells.Methods: NP cells were treated with IL- 1β.Cell proliferation was determined by CCK- 8 analysis and Ki67 immunofluorescence staining.To identify the mechanism by which IL- 1β induced proliferation of NP cells，Western blotting was carried out and selective inhibitors of MAPK and NF- κB signaling pathways were used.Results: Treatment with IL- 1β increased cell viability (as determined by CCK- 8 analysis) and the number of Ki67- positive NP cells. IL- 1β activated MAPK and NF- κB signaling pathways in NP cells. Moreover，inhibition of p38，JNK and NF- κB blocked IL- 1β- stimulated proliferation of NP cells. Conclusion: The current findings suggest that the effect of IL- 1β on intervertebral disc degeneration involves promotion of the proliferation of human NP cells via the p38，JNK and NF- κB pathways．

[Key words]interleukin 1β; nucleus pulposus cell; proliferation; MAPK; NF- κB

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.007

[中圖分類號]R329.28

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0032- 05

[通信作者]吳小濤E- mail：wuxiaotao@medmail.com.cn

[作者簡介]王小虎(1986-)，男，湖北黃岡人，在讀博士研究生。E- mail：nk_james@sina.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81272035)；東南大學基礎科研扶持項目(3290005431)

[收稿日期]2015- 09- 28[修回日期] 2015- 11- 13

[引文格式] 王小虎，吳小濤.IL- 1β通過p38、JNK和NF-κB信號通路促進髓核細胞增殖[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：32- 36.

·論著·