人參皂苷聯合地塞米松對刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠肝功能保護作用及相關機制研究

時扣榮，陳偉成，李潔，譚朝丹，劉娟，顧偉鷹

(上海市第七人民醫院 藥學部，上海　200137)

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人參皂苷聯合地塞米松對刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠肝功能保護作用及相關機制研究

時扣榮，陳偉成，李潔，譚朝丹，劉娟，顧偉鷹

(上海市第七人民醫院 藥學部，上海200137)

[摘要]目的:探討人參皂苷(GS)聯合地塞米松(Dex)對刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠肝功能的保護作用，并分析其相關機制。方法:將Wistar大鼠40只按隨機數字表法分為5組(每組8只)：模型組、GS組、Dex組、GS+Dex組及對照組。模型組即建立刀豆蛋白誘導肝損傷模型；GS組、Dex組即分別給藥Dex和GS；GS+Dex組則使用Dex和GS聯合給藥；對照組不給予任何干預。觀察記錄血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、脂質過氧化物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，肝組織中核轉錄因子kappa B(NF- κB)P65的表達及腫瘤壞死因子- α(TNF- α)和γ- 干擾素(IFN- γ)含量變化。并進行肝組織病理學檢查。結果:模型組的ALT和AST水平與對照組比較顯著上升(t=4.570、4.513，P<0.01)；GS和Dex單獨及聯合給藥組的ALT和AST水平與模型組比較均明顯降低(P<0.05)；GS+Dex組ALT水平降低程度顯著大于GS組和Dex組(t=2.263、3.072，P<0.05)，AST水平也如此(t=2.829、2.765，P<0.05)。模型組大鼠肝勻漿中的MDA 水平與對照組相比上升，而SOD活性顯著降低(t=7.515、8.514，P<0.01)，GS組的MDA 水平、SOD活性與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，GS+Dex組MDA水平降低和SOD活性升高程度顯著大于Dex組(t=2.287、2.722，P<0.05)。GS+Dex組大鼠體重顯著高于模型組及GS組(t=2.942、2.327，P<0.05)。模型組的NF- κB P65的蛋白表達與對照組比較顯著上調(t=9.428，P<0.01)，GS+Dex組下調NF- κB P65蛋白表達的程度明顯大于GS組和Dex組(t=6.428、5.246，P<0.05)。模型組的TNF- α和IFN- γ水平與對照組比較顯著上升(t=19.235、25.171，P<0.01)，GS+Dex組TNF- α水平降低程度顯著大于GS組和Dex組(t=2.313、9.053，P<0.05)，GS+Dex組IFN- γ水平降低程度亦顯著大于GS組和Dex組(t=5.171、8.933，P<0.05)。結論:GS聯合Dex可有效保護刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠的肝功能，其機制可能與抑制氧化應激、抑制NF- κB P65活性、下調 TNF- α含量、調節免疫作用有關。

[關鍵詞]人參皂苷； 地塞米松； 刀豆蛋白； 肝損傷

肝損傷指由各種原因誘導的肝功能異常，肝臟細胞發生不同程度的病理變化如變性、腫脹、凋亡、壞死及纖維化等，是多種類型肝病的共同病理基礎，持續性的嚴重肝損傷常導致肝功能衰竭[1]。我國肝病的發病率極高，治療費用每年高達1 000億，如何提高肝損傷的治療效果引起了人們的廣泛關注[2]。中藥人參是五加科植物人參 Panax ginseng C.A.Mey 的干燥根，主要產地為東北三省，具有補脾益肺、生津止渴、安神益智及大補元氣的功效。人參皂苷(GS)是其主要的活性成分，也是人參生理活性的基礎，具有抗腫瘤、抗休克、抗氧化、延緩衰老及改善心肌缺血等多種藥理作用[3- 5]。地塞米松(Dex)是一種糖皮質激素，臨床應用廣泛，具有抗炎、抑制免疫、抗休克、增強應激、抗內毒素及抑制多種細胞因子的作用[6]。建立合適的實驗性肝損傷動物模型是研究病毒性肝炎發病原理及保肝藥物作用機制的基礎，本次研究使用刀豆蛋白造模，并以此為基礎探討GS聯合Dex對刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠肝功能的保護作用及其相關機制。

1資料與方法

1.1實驗動物與分組

選取體重210～260 g的雄性Wistar大鼠40只(由第二軍醫大學實驗動物中心提供)，按隨機數字表法分為5組，每組8只，所有動物飼以普通飼料，飲自來水。在實驗前12 h禁食，飲水自由。GS組：50 mg·kg-1GS灌胃7 d后造模，造模成功后腹腔注射生理鹽水；Dex組：生理鹽水灌胃7 d后造模，造模成功后腹腔注射2.5 mg·kg-1Dex；GS+Dex組：50 mg·kg-1GS灌胃7 d后造模，造模成功后腹腔注射2.5 mg·kg-1Dex；模型組：生理鹽水灌胃7 d后造模，造模成功后腹腔注射生理鹽水；對照組：不進行任何干預。藥物及生理鹽水給藥體積按灌胃0.5 ml·(100 g)-1、腹腔注射0.3 ml·(100 g)-1計算。

1.2造模方法

采用刀豆蛋白誘導肝損傷模型，除對照組外其余大鼠均一次性尾靜脈注射刀豆蛋白 20 mg·kg-1，禁食不禁水。

1.3觀察指標

1.3.1血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性檢測采用賴氏法，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行，使用752型紫外分光光度計檢測505 nm波長處的吸光度，作出標準曲線再換算成ALT和AST值。

1.3.2脂質過氧化物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測采用考馬斯亮藍法測定勻漿蛋白含量，再根據MDA及SOD活性檢測試劑盒說明書進行操作，分別于532 nm和550 nm處測定吸光度，計算出MDA含量和SOD活性。

1.3.3大鼠肝勻漿組織中核轉錄因子kappa B(NF-κB) P65 的蛋白表達測定采用Western- blotting 法檢測。

1.3.4血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ- 干擾素(IFN-γ)測定采用雙抗體夾心ABC- ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.3.5肝組織病理學檢查采用蘇木素- 伊紅(hematoxylin- exsin，HE)染色法。

1.4統計學處理

2結果

2.1各組肝功能指標比較

模型組的ALT和AST水平與對照組比較顯著升高(t=4.570、4.513，P<0.01)，提示刀豆蛋白造模成功。GS和Dex單獨及聯合給藥組的ALT和AST水平與模型組比較均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；GS+Dex組ALT水平降低程度顯著大于GS組和Dex組(t=2.263、3.072,P<0.05)，AST水平也如此(t=2.829、2.765，P<0.05)。見表1。

組 別ALT/U·L-1AST/U·L-1MDA/nmol·(mgprot)-1SOD/U·(mgprot)-1體重/g對照組53.15±16.96154.36±24.083.39±0.91213.21±26.57260.5±15.1模型組174.65±73.26a952.31±499.53a8.82±1.83a112.45±20.36a210.6±20.5aGS組97.26±27.84bc403.46±128.08bc7.09±1.37133.59±19.07223.2±14.4cDex組110.25±31.74bc434.16±164.27bc5.87±0.76b148.49±12.04b238.4±16.9GS+Dex組71.23±16.84b267.65±45.02b4.96±0.93b166.37±14.15b253.1±12.3b

與對照組比較，aP<0.01； 與模型組比較,bP<0.05；與GS+Dex組比較，cP<0.05

與對照組相比，模型組大鼠肝勻漿中的MDA 水平升高，而SOD活性顯著降低(t=7.515、8.514，P<0.01)，表明刀豆蛋白誘導的肝損傷機制可能與氧化損傷有關。GS組的MDA 水平與模型組比較略有降低，SOD活性亦有所回升，但差異無統計學意義(P>0.05)。GS組和GS+Dex組的MDA 水平與模型組比較均顯著降低(t=4.211、5.319，P<0.05)，SOD活性則顯著升高(t=4.310、6.151，P<0.05)，且GS+Dex組MDA 水平降低和SOD活性升高程度顯著大于Dex組(t=2.287、2.722，P<0.05)，即GS+Dex組抑制氧化損傷的效果優于Dex組。造模成功后模型組的體重顯著低于對照組(t=3.012，P<0.05)，給藥后GS組、Dex組和GS+Dex組大鼠體重相對于模型組均有一定程度的增加，但GS+Dex組與模型組比較差異具有統計學意義(t=2.942，P<0.05)，同時GS+Dex組大鼠體重顯著高于GS組(t=2.327，P<0.05)。見表1。

2.2大鼠肝組織中NF-κB P65 的表達情況

采用Western- blotting法檢測大鼠肝勻漿組織中的NF-κB P65 蛋白的表達情況。結果顯示，對照組表達 NF-κB P65 蛋白較少，模型組的NF-κB P65的蛋白表達與之比較則顯著上調(t=9.428,P<0.01)。GS和Dex單獨及聯合給藥組的NF-κB P65表達與模型組比較均顯著降低(t=2.530、3.414、7.177，P<0.05)，而GS+Dex組的降低程度明顯大于GS組和Dex組(t=6.428、5.246，P<0.05)，說明GS和Dex均能在一定程度上抑制NF-κB P65 的表達，而GS與Dex聯合給藥效果最佳。見圖1、2。

圖1NF-κB P65的Western- blotting分析蛋白條帶

Fig 1Protein bands of Western- blotting analysis of NF-κB P65

與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與GS+Dex組比較，cP<0.05

圖2NF-κB P65的Western- blotting分析

Fig 2Western- blotting analysis of NF-κB P65

2.3各組TNF-α、IFN-γ含量比較

使用ELISA 法檢測大鼠肝勻漿組織中的TNF-α和IFN-γ水平，結果顯示，模型組的TNF-α和IFN-γ水平與對照組比較顯著上升(t=19.235、25.171，P<0.01)，提示刀豆蛋白造模成功。GS和Dex單獨及聯合給藥組的TNF-α和IFN-γ水平與模型組比較均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，GS+Dex組TNF-α水平降低程度顯著大于GS和Dex分別單獨給藥組(t=2.313、9.053，P<0.05)；GS+Dex組IFN-γ水平降低程度亦顯著大于GS和Dex分別單獨給藥組(t=5.171、8.933，P<0.05)。見表2。

組 別TNF-α/μg·L-1IFN-γ/μg·L-1對照組35.28±3.4718.53±2.01模型組101.83±9.15a77.21±6.28aGS組60.29±4.34bc29.47±3.93bcDex組79.16±8.12bc49.52±6.56bcGS+Dex組45.03±7.13b24.86±4.04b

與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與GS+Dex組比較，cP<0.05

2.4各組病理學檢查結果

對照組大鼠肝臟病理切片顯示其具有完整的肝小葉結構，肝細胞索整齊排列，細胞形態較為規則，無炎癥細胞浸潤；模型組肝小葉結構極為紊亂，大量肝細胞壞死，出現變性和腫脹，伴有炎癥細胞浸潤；GS組和Dex組的病理切片類似，相對于模型組，其肝細胞壞死、變性程度有所改善，但依然存在內皮細胞增生及較明顯的炎癥細胞浸潤；GS+Dex組肝細胞腫脹、壞死程度顯著減輕，炎癥細胞浸潤顯著減少，肝組織病變改善明顯。

3討論

刀豆蛋白是一種被廣泛應用的可活化T細胞的有絲分裂原，能誘發巨噬細胞和淋巴細胞的細胞毒作用[7]，刀豆蛋白A誘導的大鼠免疫性肝損傷模型是較常用的自身免疫性肝病的動物模型，其通過活化T淋巴細胞而誘發特異性肝損傷，能更好地模擬人類病毒性肝炎的致敏過程[8]。本次實驗顯示模型組的ALT和AST水平與對照組比較顯著上升(t=4.570、4.513，P<0.01)，提示刀豆蛋白造模成功。

由于很多肝病發生的共同病理基礎是肝細胞的損害，所以治療肝病的重要措施是保護肝細胞，以減弱其損傷程度，抑制或降低炎癥因子表達，對于已受損的肝細胞需加強其自身的修復能力[9]。人參分為生曬參、紅參、糖參及白參等，其主要活性成分是GS，到目前為止單體GS分離出30多種[10]，通過干擾或促進多種生化反應發揮生物活性，具有天然的抗氧化作用，研究報道GS對心血管系統、神經系統、免疫系統均有一定影響，可抑制細胞凋亡、抗衰老、擴張血管及緩解運動疲勞[11]。類固醇激素類藥物具有強大的抗炎及免疫調節作用[12]，主要藥理學機制之一是通過募集組蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase 2，HDAC2)至轉錄復合體而抑制組蛋白等乙酰化(acetylation)修飾[13]。研究顯示Dex可下調 TNF-α的表達，從而對 LPS/D- GalN 誘導的大鼠內毒素性肝損傷發揮保護作用[14]。

本次研究結果顯示，GS和Dex單獨及聯合給藥組的ALT和AST水平與模型組比較均明顯降低(P<0.05)，而GS和Dex聯合給藥的ALT水平降低程度顯著大于GS和Dex分別單獨給藥組(t=2.263、3.072，P<0.05)，AST水平也如此(t=2.829、2.765，P<0.05)。表明GS和Dex對于刀豆蛋白誘導的肝損傷均具有保護作用，而兩藥聯合應用效果更顯著。

與對照組相比，模型組大鼠肝勻漿中的MDA 水平升高，而SOD活性顯著降低(t=7.515、8.514，P<0.01)，表明刀豆蛋白誘導的肝損傷機制可能與氧化損傷有關。研究顯示GS可通過抗氧化作用保護肝損傷[15]，本次實驗結果與之一致，GS組和GS+Dex組的MDA 水平與模型組比較均顯著降低(t=4.211、5.319，P<0.05)，SOD活性則顯著上升(t=4.310、6.151，P<0.05)，且GS+Dex組MDA 水平降低和SOD活性升高程度顯著大于Dex組(t=2.287、2.722，P<0.05)，即GS+Dex組抑制氧化損傷的效果優于Dex組。

巨噬細胞和輔助性T細胞(TH)是刀豆蛋白誘導大鼠肝損傷模型的效應細胞。當刀豆蛋白活化TH細胞后刺激其與巨噬細胞產生大量TNF-α等細胞因子，介導肝損傷。使用ELISA 法檢測大鼠肝勻漿組織中的TNF-α和IFN-γ含量，結果顯示，模型組的TNF-α和IFN-γ水平與對照組比較顯著升高(t=19.235、25.171，P<0.01)，而GS+Dex組TNF-α水平降低程度顯著大于GS和Dex分別單獨給藥組(t=2.313、9.053，P<0.05)；GS+Dex組IFN-γ水平降低程度亦顯著大于GS和Dex分別單獨給藥組(t=5.171、8.933，P<0.05)。

NF-κB P65存在于大部分細胞的胞漿中，當受到外界刺激后入核活化，誘導氧化應激，加劇肝臟損傷，采用Western- blotting法檢測大鼠肝勻漿組織中的NF-κB P65 蛋白的表達情況。結果顯示，對照組表達 NF-κB P65 蛋白較少，模型組的NF-κB P65的蛋白表達與之比較則顯著上調，而GS+Dex組的降低程度明顯大于GS組和Dex組(t=6.428、5.246，P<0.05)，說明GS和Dex均能在一定程度上抑制NF-κB P65 的表達，且病理學檢查結果顯示聯合給藥顯著改善了肝組織病變程度，即GS與Dex聯合給藥效果最佳。

綜上所述，GS聯合Dex可有效保護刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠的肝功能，其機制可能與抑制氧化應激、抑制NF-κB P65活性、下調 TNF-α含量、調節免疫作用有關。

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Protective effects and related mechanism of ginsenoside combined with dexamethasone on concanavalin incuced liver injury rats mode

SHI Kou- rong， CHEN Wei- cheng， LI Jie， TAN Zhao- dan， LIU Juan， GU Wei- ying

(DepartmentofPharmacy，ShanghaiSeventhPeople’sHospital，Shanghai200137，China)

[Abstract]Objective: To explore the protective effects of ginsenoside(GS) combined with dexamethasone(Dex) on concanavalin incuced liver injury rats mode and analyse the related mechanism.Methods: 40 Wistar rats were randomly divided into five groups(n=8): model group， GS group， Dex group， GS+Dex group and control group.The rats model with actue hepatic injury induced by injection of concanavalin was established.GS group and Dex group were administered Dex and GS separately.GS+Dex group used co- administration of GS and Dex.Control group was not given any intervention.Serum alanine aminotransferase(ALT)， aspartate aminotransferase(AST)， malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) levels were recorded and the expression of liver tissue nuclear transcription factor kappa B(NF- κB) P65 and tumor necrosis factor- α(TNF- α) and γ- interferon(IFN- γ) levels were analyzed.liver tissue was histopathologically examined with hematoxylin- exsin( HE) staining.Results: ALT and AST levels of the model group was significantly higher than control group(t=4.570，4.513；P<0.01).ALT and AST levels of GS group，Dex group and GS+Dex group were significantly lower than model group(P<0.05).The decreased level of ALT in GS+Dex group significantly greater than GS group and Dex group(t=2.263，3.072；P<0.05).The same as AST(t=2.829，2.765；P<0.05).MDA levels of the model group was significantly higher than control group and SOD activity was lower than control group (t=7.515，8.514；P<0.01).MDA levels and SOD activity had no significantly difference between GS group and model group(P>0.05).MDA levels and SOD activity had significantly difference between Dex group and GS+Dex group(t=2.287，2.722；P<0.05).The weight of rats in GS+Dex group was significantly greater than control group and GS group(t=2.942，2.327；P<0.05).Protein expression of NF- κB P65 of the model group was significantly higher than control group(t=9.428,P<0.01).The increased level of NF- κB P65 in GS+Dex group significantly greater than GS group and Dex group(t=6.428，5.246；P<0.05).TNF- α and IFN- γ levels of the model group was significantly higher than control group(t=19.235，25.171；P<0.01).The decreased level of TNF- α in GS+Dex group was significantly greater than GS group and Dex group(t=2.313，9.053；P<0.05).The same as IFN- γ levels(t=5.171，8.933；P<0.05).Conclusion: Ginsenoside combined with dexamethasone can effectively protect the liver function of concanavalin- induced liver injury in rats.The mechanism may be related to inhibition of oxidative stress and activity of NF- κB P65 which can reduce TNF- α and regulate immune function．

[Key words]ginsenosides； dexamethasone； concanavalin； liver injury

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．013

[中圖分類號]R575； R965

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0058- 05

[作者簡介]時扣榮(1983-)，女，江蘇鹽城人，主管藥師。E- mail：shikourongzh11@163.com

[基金項目]上海市第七人民醫院“七院新星”人才培養項目(XX2012- 026)

[收稿日期]2015- 06- 23[修回日期] 2015- 11- 16

[引文格式] 時扣榮，陳偉成，李潔，等.人參皂苷聯合地塞米松對刀豆蛋白所致肝損傷模型大鼠肝功能保護作用及相關機制研究[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(1)：58- 62.

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