卵巢癌腹水來源微囊體促進卵巢癌SKOV3細胞增殖和耐藥

熊愛為，謝靜燕，趙樹立

[1.南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院) 婦科，江蘇 南京　210006； 2.南京醫科

大學附屬南京醫院(南京市第一醫院) 中心實驗室，江蘇 南京　210006]

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卵巢癌腹水來源微囊體促進卵巢癌SKOV3細胞增殖和耐藥

熊愛為1，謝靜燕1，趙樹立2

[1.南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院) 婦科，江蘇 南京210006； 2.南京醫科

大學附屬南京醫院(南京市第一醫院) 中心實驗室，江蘇 南京210006]

[摘要]目的:通過檢測卵巢癌患者腹水來源的微囊體(MVs)體外促進人卵巢癌細胞株增殖及對順鉑的藥物耐受作用，探討腹水MVs對卵巢癌發生發展及治療的影響。方法:采用超速離心法分離獲得6例惡性卵巢癌腹水中的MVs，在體外觀察MVs對卵巢癌細胞SKOV3增殖的影響，并觀察不同MVs濃度下SKOV3細胞株對順鉑細胞毒性的耐藥效果。結果:成功從卵巢癌腹水中獲得了MVs，加入MVs組與對照組相比，能明顯促進SKOV3細胞的增殖(P<0.05)，且呈一定的濃度依耐性。一定濃度的MVs可以抑制低濃度的順鉑的細胞毒性(P<0.05)，當藥物濃度增大(順鉑 10 μg·ml-1，紫杉醇 10 μg·ml-1)MVs的抑制作用沒有意義(P>0.05)。結論:卵巢癌腹水來源的MVs能明顯促進卵巢癌細胞的增殖，并在卵巢癌細胞對低濃度的順鉑藥物耐受中起促進作用，為臨床卵巢癌治療過程中腹水MVs的檢測提供新的臨床意義。

[關鍵詞]卵巢癌； 微囊體； 增殖； 化療； 耐藥

微囊泡(microvesicles，MVs)是指細胞在靜息或活化狀態下分泌的一種由脂質雙分子層膜包裹著蛋白質、DNA、mRNA、miRNA及lncRNA等生物活性物質的膜性小囊泡，包括直徑在 150~1 000 nm 的微粒(microparticle ) 和 30~150 nm 的外來體(exosome)[1]。作為一種特殊的轉運載體，MVs可以轉運蛋白質和功能遺傳物質(如DNA、RNA等)到其它細胞，被認為是一種細胞間信號傳遞的重要分子[2- 3]。近年來，它的信號傳遞功能得到了認可，被認為是除了可溶性信號分子和膜錨定受體蛋白之外的、存在于血清等多種體液中的第三種信號傳遞途徑。越來越多的研究表明，MVs參與了多種病理發生和發展進程[4- 5]。最近研究發現，在正常細胞中MVs一般是從細胞質膜的特定區域脫落釋放的，而在腫瘤細胞中MVs可以從整個細胞表面脫落釋放，而且釋放的量也比正常細胞多。晚期惡性腫瘤腹水來源的MVs內包涵著少量腫瘤特異的信號蛋白、miRNAs等信號分子[6]，有研究表明其與惡性腫瘤的遠處轉移、臨床分級、預后明顯相關[5]，而關于惡性腫瘤來源的MVs對腫瘤細胞本身細胞增殖及對化療藥物保護作用尚無研究。

本研究試圖從卵巢癌患者惡性腹水中分離MVs，并通過在體外培養時觀察MVs對卵巢癌細胞株的促增殖效應以及對順鉑的細胞毒性抑制作用，進一步探討利用卵巢癌患者惡性腹水中MVs的生物學效應。

1材料與方法

1.1材料來源

1.1.1細胞系卵巢癌上皮細胞SKOV3購于中科院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器RPMI DMEM培養基、胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、胰蛋白酶EDTA消化液、CCK- 8細胞增殖及毒性檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒、Annexin V- PI細胞凋亡檢測試劑盒均購于南京凱基生物科技發展有限公司，四季青血清購于杭州天杭生物科技有限公司，順鉑來自于南京市第一醫院靜脈輸液配置中心，酶標儀BIO- RAD購于上海賽默科技生物發展有限公司，流式細胞儀BDFACS Canto Ⅱ購于美國BD公司，低溫超速離心機Optima XPN購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養SKOV3細胞用含10%血清的RPMI DMEM培養基培養，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，2～3 d更換培養基。

1.2.2MVs提取收集原發性卵巢癌患者腹水100 ml，患者已簽署知情同意書，腹水收取前未經化療或手術治療，轉移腹水至無菌50 ml離心管，300×g離心10 min去除活細胞，吸取上清液，轉移至新的無菌管，2 000×g離心10 min去除死細胞，收集上清，低溫超速離心機10 000×g離心30 min去除細胞碎片，收集上清，低溫超速離心機100 000×g離心70 min得到MVs和少量其他蛋白，PBS溶液重懸MVs和混雜蛋白，低溫超速離心機100 000×g離心70 min，去除上清，得到MVs，PBS重新溶解后分裝于無菌EP管，每管吸取5 μl用BCA法測定MVs中的蛋白濃度來表示MVs的量，定量后放置于-80 ℃備用。

1.2.3細胞增殖檢測SKOV3細胞生長至融合度為90%時用胰蛋白酶EDTA消化液消化細胞，加入適當培養基，吹勻后細胞計數，使細胞最終密度為1×105ml-1，96孔板每孔加入100 μl吹勻后的細胞，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，24 h后加入MVs，使之濃度梯度分別為0、2.5、5、10、15和 20 ng·ml-1，并設置6復孔，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中共培養，24 h后每孔加入10 μl新型細胞增殖及毒性檢測溶液CCK- 8(南京凱基生物科技發展有限公司 KGA317)，置于37 ℃培養箱中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度OD值。細胞增長率(%)=(OD值MVs-OD值空白)/OD值空白×100%。

1.2.4順鉑細胞毒性檢測卵巢癌細胞株SKOV3培養至融合度為50%時分別加入0、5和15 ng·ml-1的MVs孵育48 h，消化收集細胞分鋪于96孔板(5×104個·well-1)，細胞貼壁后加入終濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 or 20 μg·ml-1含順鉑培養基，每個濃度設4個復孔。培養48 h后加入CCK- 8試劑繼續孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長各孔吸光值(A)。計算每組細胞順鉑的IC50值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期卵巢癌細胞株SKOV3培養至融合度為50%時，分別加入0、5和15 ng·ml-1的MVs孵育48 h后，每孔分別加入5和10 μg·ml-1順鉑，并設置MVs對照組和SKOV3對照組，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，孵育24 h后用胰蛋白酶消化液(不含EDTA)消化細胞，離心收集細胞后用PBS洗滌細胞1次(2 000 r·min-1，5 min)，300 μl的1×Binding Buffer懸浮細胞，之后加入5 μl Annexin V- FITC混勻后避光、室溫孵育15 min，上機前5 min再加入5 μl的PI染色，避光放置10 min，流式細胞儀檢測各組凋亡率。細胞周期檢測：取0、5和15 ng·ml-1的MVs預孵育細胞，用0和5 μg·ml-1順鉑處理24 h后收集細胞，用PBS洗滌細胞1次(2 000 r·min-1離心5 min)，收集1×106細胞，加入70%的冷乙醇500 μl固定，4 ℃過夜，染色前用PBS洗去固定液，加入100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測，記錄繼發波長488 nm處紅色熒光。分別統計各組細胞的死亡率(PI+，%)和細胞周期(G0/G1期、S期和G2/M期)。

1.3統計學處理

使用軟件SPSS 13.0，各組間差異用χ2檢驗或獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1MVs促進卵巢癌細胞SKOV3增殖

成功從6例晚期卵巢癌患者的腹水中(腹水內癌細胞陽性)通過低速離心、高速離心和超速離心等方法分離出MVs。MVs可以在一定濃度范圍內刺激卵巢癌細胞SKOV3增殖:在濃度為2.5 ng·ml-1時沒有增殖活性(P>0.05)；在濃度≥5 ng·ml-1時可以促進SKOV3細胞增殖(P<0.05)，并且在5、10、15 ng·ml-1時增殖活性成濃度依賴性；而當MVs濃度為20 ng·ml-1時增殖活性達到平臺期(圖1)。

與0 ng·ml-1比較，aP<0.05

圖1MVs促進卵巢癌細胞SKOV3增殖

Fig 1Microvesicles promoted the proliferation of SKOV3

2.2MVs增加順鉑對SKOV3細胞的IC50值

CCK8比色法檢測顯示，對空白對照組相比，10 ng·ml-1的MVs預處理48 h后SKOV3細胞對順鉑IC50值明顯升高(P<0.05)，而5 ng·ml-1MVs預處理組則差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。結果表明，MVs可以提高SKOV3細胞對順鉑的耐藥性。

與0 ng·ml-1比較，aP<0.05

圖2MVs增加順鉑對SKOV3細胞的IC50值

Fig 2Microvesicles improved the tolerance of skov3 for cis- platinum

2.3MVs降低順鉑對SKOV3細胞的細胞毒性

流式細胞儀檢測顯示，在低劑量的順鉑(5 μg·ml-1)處理組，MVs可以呈一定劑量依賴性地降低順鉑導致的SKOVE3細胞的死亡率(PI+，%)(P<0.05)，但當順鉑濃度加大到10 μg·ml-1時MVs對SKOV3細胞的耐藥促進能力差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。因此，我們隨后檢測了在MVs的作用下，5 μg·ml-1順鉑引起的SKOV3細胞周期的變化情況，結果表明15 ng·ml-1MVs預處理組S期細胞比例明顯低于空白對照組(P<0.05)，在相同條件下，5 ng·ml-1順鉑處理組各細胞周期比例則差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表1MVs處理下SKOV3細胞死亡率

Tab 1The mortality of SKOV3 imposed on microvesicles

順鉑濃度不同MVs濃度下SKOV3細胞死亡率/%0ng·ml-15ng·ml-115ng·ml-15μg·ml-127.3±4.522.3±3.4a20.9±4.3a10μg·ml-151.1±9.148.3±5.747.9±7.2

與0 ng·ml-1MVs處理組比較，aP<0.05

3討論

目前關于惡性腫瘤細胞來源MVs的研究尚少，僅有的研究只表明惡性腫瘤細胞來源的MVs與腫瘤細胞之間的雙向信號傳遞有關[3, 7]，并有可能參與腫瘤細胞免疫逃逸[4, 6,8- 9]。本實驗表明卵巢癌腹水來源MVs可在體外刺激卵巢癌SKOV3細胞增殖，迄今為止國際上尚無學者進行相關實驗，僅有Giusti 等學者發現肺小細胞癌來源MVs在體外一定濃度下能顯著促進小細胞癌間質干細胞的增殖，但相關機制尚無闡述。關于本實驗MVs促進SKOV3細胞增殖的機制存在兩種可能：(1) 卵巢癌腹水來源MVs中除包含RNA、miRNA、基因組DNA等核酸類物質外，還包含生長因子及生長因子受體[10]，卵巢癌細胞膜表面釋放出的MVs在被臨近細胞胞飲的過程中囊內生長因子與臨近細胞膜表面生長因子受體相結合，促進細胞增殖；(2) 卵巢癌腹水來源MVs中包含有mRNA、miRNA、轉錄調節因子、抗原提呈物質等成分，參與細胞間信號傳遞，使細胞間信號連接增強，可能通過細胞間共刺激作用促進細胞增殖。如加拿大麥吉爾大學Janusz Rak等研究發現，神經系統惡性腫瘤細胞間共刺激分子如人類白細胞抗原1(human leukocyte antigen 1，HLA- 1)、淋巴細胞功能相關抗原等物質表達異常活躍[10]，可能由此發揮其促增殖作用。

表25 μg·ml-1順鉑處理后SKOV3細胞周期%

Tab 2The cell cycle of skov3 imposed on the cis- platinum of 5 μg·ml-1

%

與0 ng·ml-1MVs處理組比較，aP<0.05

關于MVs促進惡性腫瘤細胞耐藥的研究尚無報道，但有學者預測其可能參與化療藥物保護[11]。本實驗表明一定濃度的MVs可顯著促進卵巢癌細胞對順鉑的耐受，特別是當MVs濃度低于10 μg·ml-1時MVs對于SKOV3細胞的耐藥促進能力較為明顯。 Giusti等[10]在電鏡下觀察到惡性腫瘤細胞膜表面釋放的MVs異常活躍，惡性腫瘤細胞可以MVs的形式向外排出胞內積聚的細胞凋亡效應因子半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase- 3)，而MVs的釋放被抑制后，半胱天冬氨酸在胞內明顯積聚且細胞凋亡率明顯升高；除了釋放細胞凋亡抑制因子，有學者觀察到，在用多柔比星作用于腫瘤細胞后，細胞內積聚的藥物以及釋放的MVs中包含的藥物濃度明顯升高[12- 14]，且發現協助腫瘤細胞逃逸的基因表達也異常升高[15- 16]，但具體機制尚無闡述。本實驗對于細胞周期的進一步分析表明，低劑量的順鉑(5 μg·ml-1)處理下，當MVs的處理濃度增加到15 ng·ml-1時，各個細胞周期的變化較為明顯，表現為S期細胞比例顯著降低，而G0/G1以及G2/M期細胞比例顯著升高，提示MVs可能通過調節細胞周期來發揮其耐藥作用。

卵巢癌腹水來源的MVs對腫瘤細胞促增殖作用及對順鉑保護作用的研究開創了惡性腫瘤細胞來源MVs研究的全新領域，為卵巢癌合并腹水的患者術中如何妥善處理腹水提供理論基礎，為卵巢癌特別是合并明顯腹水的病人術后輔助使用化療藥物中如何降低化療藥物耐受提供了全新的研究領域，但MVs促卵巢癌細胞增殖的作用及耐藥機制有待進一步探索。

[參考文獻]

[1] LIANG B,PENG P,CHEN S,et al.Characterization and proteomic analysis of ovarian cancer- derived exosomes[J].Mol Cancer,2013,80(2):171- 182．

[2] SHENDER V O,PAVLYUKOV M S,ZIGANSHIN R H,et al.Proteome- metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication[J].Mol Cancer,2014,13(4):355- 357．

[3] CHEVILLET J R,KANG Q,RUF I K,et al.Quantitative and stoichiometric analysis of the microRNA content of exosomes[J].Eur J Pharmacol,2013,80(2):17- 23．

[4] CAPPELLESSO R,TINAZZI A,GIURICI T,et al.Programmed cell death 4 and microRNA 21 inverse expression is maintained in cells and exosomes from ovarian serous carcinoma effusions[J].Cancer Cytopathol,2014,122(9):685- 693．

[5] FUJITA Y,KUWANO K,OCHIYA T,et al.The impact of extracellular vesicle- encapsulated circulating microRNAs in lung cancer research[J].Biomed Res Int,2014,20(14):1- 8．

[6] LI J,ZHANG Y,LIU Y,et al.Microvesicle- mediated transfer of microRNA- 150 from monocytes to endothelial cells promotes angiogenesis[J].J Biol Chem,2013,288(32):23586- 23596．

[7] JAISWAL R,LUK F,GONG J,et al.Microparticle conferred microRNA profiles- - implications in the transfer and dominance of cancer traits[J].Mol Cancer,2012,11(2):37- 44．

[8] COLOMBO M,RAPOSO G,THERY C.Biogenesis,secretion,and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2014,30(4):255- 289．

[9] YAMADA N,TSUJIMURA N,KUMAZAKI M,et al.Colorectal cancer cell- derived microvesicles containing microRNA- 1246 promote angiogenesis by activating Smad 1/5/8 signaling elicited by PML down- regulation in endothelial cells[J].Biochim Biophys Acta,2014,1839(11):1256- 1272．

[10] GIUSTI I,D ASCENZO S,DOLO V.Microvesicles as potential ovarian cancer biomarkers[J].Biomed Res Int,2013,20(13):1- 12．

[11] PASCUCCI L,COCCV,BONOMI A,et al.Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibitinvitrotumor growth:A new approach for drug delivery[J].J Control Release,2014,192(11):262- 270．

[12] GONG J,LUK F,JAISWAL R,et al.Microparticle drug sequestration provides a parallel pathway in the acquisition of cancer drug resistance[J].Eur J Pharmacol,2013,721(13):116- 125．

[13] van DOMMELEN S M,VADER P,LAKHAL S,et al.Microvesicles and exosomes:Opportunities for cell- derived membrane vesicles in drug delivery[J].J Control Release,2012,161(2):635- 644．

[14] JOHNSEN K B,GUDBERGSSON J M,SKOV M N,et al.A comprehensive overview of exosomes as drug delivery vehicles—Endogenous nanocarriers for targeted cancer therapy[J].Biochim Biophys Acta,2014,1846(1):75- 87．

[15] 劉夢娜，謝靜燕，趙樹立.雌激素受體在卵巢癌研究中的進展[J].東南大學學報:醫學版，2014，33(2):215- 218．

[16] 趙一兵，吳強，曲軍衛，等.卵巢癌腫瘤細胞減滅術的危險因素分析[J].東南大學學報:醫學版，2014，33(6):696- 698．

Microvesicles extracted from the ascites can promote SKOV3 cell line proliferation and protect the cell toxicity

XIONG Ai- wei1，XIE Jing- yan1，Zhao Shu- li2

(1.DepartmentofGynaecology，NanjingFirstHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210006，China; 2.DepartmentofCenterLaboratory，NanjingFirstHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210006,China)

[Abstract]Objective: To extract the microvesicles from the ascites of patients with ovarian cancer and explore the proliferation effect on SKOV3 cell lines or toxicity. Methods: The microvesicles from the ascites were got by using the ultracentrifugation. The proliferation effects of SKOV3 cell lines was observed. The cell survival proportion when exposed to cis- platinum in different concentration of microvesicles was paid attention to. Results: We succeeded in acquiring the microvesicles. The SKOV3 cell lines exposed to microvesicles showed significant proliferation effect， which depended on the concentration to some extent. A low concentration of microvesicles could protect the toxicity from the cis- platinum (P<0.05)， but not any significance was observed when the concentration was getting high. Conclusion: The microvesicles from the ascites of patients with ovarian cancer can stimulate the proliferation of SKOV3 cell lines in vitro and help resist the cell toxicity effect of cis- platinum in a low concentration， which sheds lights into the therapy of ovarian cancer especially the patiens with ascites．

[Key words]ovarian cancer; microvesicles; proliferation; chemotherapy; drug resistance

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.016

[中圖分類號]R737.31

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0071- 05

[通信作者]謝靜燕E- mail：xiejingyan2001@163.com；趙樹立E- mail：shulizhao79@gmail.com

[作者簡介]熊愛為(1989-)，男，江蘇宿遷人，在讀碩士研究生。E- mail：750704942@qq.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81572557)；南京市醫學科技發展基金資助項目(201308002, JQX13004)

[收稿日期]2015- 05- 12[修回日期] 2015- 11- 16

[引文格式] 熊愛為,謝靜燕,趙樹立.卵巢癌腹水來源微囊體促進卵巢癌SKOV3細胞增殖和耐藥[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(1)：71- 75.

·論著·