細胞膜色譜法在防治心腦血管疾病研究中的應用

宋丹寧，隋殿軍* ，李 娜，李 輝

(1.長春中醫藥大學， 長春 130117；2.吉林省前衛醫院，長春 130000)

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細胞膜色譜法在防治心腦血管疾病研究中的應用

宋丹寧1，隋殿軍1*，李 娜1，李 輝2

(1.長春中醫藥大學， 長春 130117；2.吉林省前衛醫院，長春 130000)

隨著社會壓力和老齡化的發展，心腦血管疾病成為嚴重影響人們健康的重要疾病，高通量篩選和開發防治心腦血管疾病的藥物成為中藥研究的熱點。生物色譜膜因其具有高穩定性、高重復性、靈敏快捷等特點逐漸在防治心腦血管疾病藥物開發中受到重視。細胞膜色譜法的運用加快了中藥有效成分分離純化的進展，有望實現其高通量的篩選，對心腦血管疾病的防治具有深遠的影響。

生物色譜技術；心腦血管疾病；細胞膜色譜法

隨著科學技術的迅速發展，各種新興技術和交叉技術的不斷出現，生物色譜法隨之產生，并廣泛應用于中藥的質量監控、活性成分的篩選、藥物與受體及受體亞型親和作用，對于中藥在藥理學中的應用與研究均具有促進作用。大多數中藥都含有大量的化學成分,由于產地、環境、炮制和貯存方式的不同[1]，其對應的活性也有顯著不同，因此運用生物色譜進行譜效學的研究具有重要意義。

1 細胞膜色譜法概況

生物色譜技術是采用各種具有生物活性的材料作為固定相，進行分離和制備具有生物活性的藥物組分的一種技術，一般選用活性細胞膜、植物細胞、活性細胞、生物大分子作為固定相。根據不同的固定相可將生物色譜法分為細胞膜色譜法、細胞生物色譜法、分子生物色譜法等[2]。

其中細胞膜色譜法(CMC)是將動物或植物活性細胞膜結合到活化的硅膠表面，制成細胞膜固定相(CMSP)，藥物作為流動相在色譜中進行流動，根據不同的活性成分和作用程度的差別表現出不同的保留特性，由此進行中藥活性成分的分離純化與篩選和每種成分作用的靶點與受體的研究[3]。中藥在進入CMSP后，色譜柱將具有活性的化學成分或化學有效結構進行保留，并且將這些成分進行分析鑒定，無活性的組分則隨之流出，可得到單味中藥未知的活性單體或化合物。CMC將高效液相色譜、細胞生物學以及藥理學相結合，根據受體學說，利用中藥與膜受體之間存在的特異性親和力，通過色譜參數，探究藥物與細胞膜受體之間的相互作用，更進一步研究藥物在細胞上作用的機制，對中藥藥理學研究具有重要意義。CMC還存在另一種細胞膜色譜模型，是直接選取效應器官的細胞膜和中藥提取液共同在適宜的培養基中進行孵育，一段時間后利用活性細胞膜去固相化中藥的成分，使效應成分與細胞膜進行特異性結合，再進行分離和鑒定。

2 細胞膜色譜法應用

將CMC與高效液相色譜聯用，篩選出紅毛七中的活性成分紅毛新堿(caulophine)，能夠與塔斯品堿共同作用于表皮生長因子受體。將HEK293細胞膜作為固定相，篩選出紅毛七中能與α1受體結合的活性物質為紅毛新堿，作為α1受體抑制劑。運用CMC，并結合LC-MS聯用色譜法檢測在前列腺細胞膜固定相模型上，篩選鉤藤中與α1A腎上腺受體(α1A-AR)結合的活性成分，檢測出鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿4種單體均能與α1A-AR結合并且產生活性[4]。

將高表達EGFR的HEK293細胞膜與硅膠載體進行結合作為固定相，通過與質譜(MS)聯用，檢測馬錢子中抗EGFR的活性成分為馬錢子堿和番木鱉堿，能夠減輕胞外信號調節激酶(Erk)的磷酸化，組織下游相關信號分子的表達，抑制HEK293細胞的增殖[5]。選用硅膠作為載體制備前列腺細胞膜固定相，結合LC/MS進行測分析，得到蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿、荷花堿幾種α1受體抑制劑活性成分[6]。通過CMC與LC/MS技術的相結合，初步篩選和鑒定出中藥佛手中能作用于血管平滑肌細胞膜上受體的有效成分為佛手柑內酯[7]。

選取大鼠心肌細胞作為固定相，利用CMC并結合高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)篩選出烏頭中8種具有生物活性的化學成分[8]。進一步通過CMC對烏頭進行篩選，篩選出作用于心肌細胞膜的4種活性成分，分別為塔拉烏頭胺(TALA)、14-乙酰基-塔拉烏頭胺(14-acetyl-TALA)、異葉烏頭素(hetisine)、14-benzoylneoline，這四種成分能夠阻礙阿霉素誘導的心衰[9]，減輕心臟的損害。

通過建立SH-SY5Y細胞膜固相色譜模型，將遠志皂苷堿水解產物作用于H2O2處理后SH-SY5Y細胞膜，篩選出與細胞膜相互作用且具有抗早老性癡呆的活性成分，再經過HPLC對活性成分進行分析鑒定，分別為細葉遠志皂苷、黃花倒水蓮皂苷A、3,4,5-三甲基肉桂酸和對甲氧基肉桂酸。

對于藥物與受體相互作用的方法有放射性培基結合法(RBA)、功能實驗分析法(FTA)、熒光內反射法(TIRF)、親和色譜法(AC)以及液閃接近測定技術(SPA)等，而這些方法雖然靈敏度高且準確，但操作復雜且費時，會造成同位素對環境的污染，對于非放射性標記藥物不能直接獲得與受體作用的信息，相比之下CMC的研究方法簡便、靈敏度高、效率高。

對荷蘭豬的空腸細胞膜進行CMC和RBA兩種方法的建立，通過兩種方法對8種毒蕈堿受體配體與毒蕈堿受體的親和作用進行對比和比較，結果顯示，CMC得到的色譜參數與RBA檢測的親和力具有相同的順序[10]。檢測4種川芎化學成分在心肌細胞膜固定相的色譜柱上的保留特性，探討這4種化學成分與心肌細胞膜受體的親和性和相互作用[11]。將體外培養的ECV304細胞作用在硅膠的載體上，制備成ECV304細胞膜固定相，利用血管內皮細胞膜色譜模型篩選出紅毛七中的活性成分，并且進一步研究發現，其中含有的塔斯品堿在色譜條件下能選擇性地作用于血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)，且抑制血管內皮細胞生長因子(VEGF)誘導的血管內皮細胞官腔的形成[12]。將9種藥物作用于血管內皮細胞膜色譜模型，檢測這9種不同的配體與受體的親和順序，結果表明血管內皮細胞膜色譜模型穩定性較高。

通過A431細胞膜色譜模型篩選出苦參中苦參堿和氧化苦參堿能夠作用于表皮生長因子受體(EGFR)，且親和程度與作用方式與吉非替尼相似[13]。將建立的HepG2細胞膜色譜模型聯用質譜分析，分選出黃柏中黃連素和延胡索乙素，以及苦參中的苦參堿和氧化苦參堿4種活性成分，能與HepG2細胞膜的EGFR相結合[14]。建立大鼠紋狀體細胞膜色譜模型，將川芎-白芷藥對注入色譜柱中，檢測出川芎-白芷藥對可能與5-羥色胺(5-HT)受體結合，從而激活5-HT受體，收縮顱外血管，減輕發作時顱外血管的擴張，治療偏頭痛[15]。

3 結語

CMC通過與高效液相色譜、液相色譜-質譜聯用等技術的結合，廣泛應用于中藥的分離純化和活性篩選，而且具有高穩定性、高重復性、靈敏快捷等特點。CMC也可對藥物與細胞膜結合后相關的參數，分析藥物活性成分與膜受體蛋白結合的親和力，其結合更為特異性、適用性、多靶點性等特點。CMC的運用加快了中藥有效成分的分離純化的進展，有望實現其高通量的篩選，促進了現代中藥藥理的研究和發展，對心腦血管疾病的防治具有深遠的影響。

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Cell Membrane chromatography in application of prevention and treatment of disease of heart head blood-vessel

SONG Danning1,SUI Dianjun1*,LI Na1,LI Hui2

(1.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Avant-garde Hospital of Jilin Province,Changchun 130000,China)

With the development of social pressure and aging,disease of heart head blood-vessel has become an important disease,serious impact on people's health and development of high-throughput screening of prevention and cure of disease of heart head blood-vessel drugs become hot topics in the study of traditional Chinese medicine (TCM).Biological membrane chromatography because of its characteristics such as high stability,high repeatability,sensitive and quick gradually in the prevention and treatment of disease of heart head blood-vessel drug development.Cell membrane chromatography used to speed up the progress in the isolation and purification of effective components of traditional Chinese medicine,is expected to achieve its high throughput screening,have a profound effect on the prevention and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases.

biological chromatography technology;disease of heart,head and blood-vessel;cell membrane chromatography

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.057

吉林省科技發展計劃項目(20130522046JH)；吉林省衛生廳青年科研(2013Q001)；吉衛科技教函(201444)。

宋丹寧(1981-)，男，助教，博士研究生，主要從事中醫內科心腦血管疾病研究。

R329.2

A

2095-6258(2016)06-1262-03

2015-11-26)

*通信作者：隋殿軍，男，教授，電子信箱-804910835@qq.com