Toll樣受體在骨關節炎中的作用研究新進展

王 歡,王慶甫,殷岳杉,張 棟,王偉利,丁昊彬,郭玉茹,杜汪洋,甘 穩,徐銘康

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029)

?

Toll樣受體在骨關節炎中的作用研究新進展

王 歡1,王慶甫2*,殷岳杉2,張 棟1,王偉利1,丁昊彬1,郭玉茹1,杜汪洋1,甘 穩1,徐銘康1

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029)

Toll樣受體(TLRs)是固有免疫系統中一類重要的模式識別受體(PRRs)，通過對不同病原相關分子模式(PAMPs)和內源性危險信號相關分子模式(DAMPs)的識別，觸發髓樣分化因子88(MyD88)依賴和非依賴途徑，激活NF-κB信號轉導通路，引起細胞因子和炎性介質的分泌，啟動固有免疫應答，在骨關節炎的進程中發揮著重要的作用。研究TLR家族分子及其介導的NF-κB信號轉導通路及其在OA中的作用，對進一步闡明OA發生發展機制、提供更有效的預防及治療方案提供理論依據。

Toll樣受體；骨關節炎；NF-κB信號通路

骨性關節炎(Osteoarthritis,OA)是以關節軟骨退行性改變和骨質增生為主要特征的慢性疾病，伴軟骨下骨變性、骨贅形成及滑膜炎癥[1]。其具體發病機制尚未完全闡明，但最新研究表明，固有免疫應答在OA的發生與發展過程中起到關鍵的作用[2]。其中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是固有免疫系統中一類重要的模式識別受體(PRRs)，廣泛參與病原相關分子模式(PAMPs)的識別及內源性危險信號相關分子模式(DAMPs)的感知，進而啟動固有免疫應答[3]。筆者就TLR家族分子及其介導的NF-κB信號轉導通路及其在OA病理機制中的研究進展作一綜述。

1 TLRs的生物學特征

20世紀末，隨著第一個TLR的發現，人們對TLRs及其相關的固有免疫的研究開啟了一個新時代。LEMALTRE等于1996年發現toll是一種對只有先天免疫的果蠅宿主防御真菌感染的關鍵受體[4]。MEDZHITOV.R 等于1997 年發現一個哺乳動物Toll樣受體的同系物(現在命名為TLR4)可誘導炎癥反應相關基因的表達[5]，因與果蠅胚胎發育過程中的Toll基因有關，因此取名為Toll樣受體。到目前為止，已有13個TLRs成員被確定發現，其中，TLR1 至TLR10在人類均有表達[6]，TLRs是一種相對分子質量在90～15O kDa之間的PRRs,作為膜結合糖蛋白受體，所有的TLRs同源分子均屬守恒的I型跨膜蛋白，由N端胞外配體識別區、跨膜區和C端胞內信號區3個主要部分組成。其中，胞外區成彎曲的馬鞍狀，由16～28個富亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats,LRRs)構成，為配體識別部位,主要行使識別PAMPs和DAMPs的功能；跨膜區主要由大約20個不帶電的不規則伸展的疏水殘基構成,與包膜結合固定受體，一般認為，此區的結構域對決定TLRs分子的亞細胞定位和分子特性起決定性作用[7]。胞內信號區因與IL-1受體高度同源，也被稱為Toll/IL-1受體同源結構域(Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR結構域)，借其嗜同性作用募集下游含有TIR的信號轉接蛋白進入細胞內，介導其間相互作用并組成蛋白-蛋白信號復合體[8]。

不同的TLRs能通過識別幾近涵蓋全部人類可遇病原體及產物的PAMP或DAMP,獲得固有免疫。例如，作為重要的模式識別受體的成員，TLR-2的識別范圍較廣，其配體主要包括外源性配體如G+菌細胞壁肽聚糖和脂磷壁酸(LTA)、某些細菌及支原體的脂蛋白或圓柱形脂多肽(lipopeptides，LPS)、分枝菌屬的阿拉伯糖甘露糖脂(lipoarabinomannan，LAM)、糖基、及酵母菌的酵母多糖(Zymosan)等；亦可識別內源性 DAMPs 配體如透明質酸(hyaluronic acid,HA)、高遷移率族蛋白-1(HMGB-1)及熱休克蛋白以等[12]。值得一提的是 TLR2 還可以與非TLRs的分子結合，如：巨噬細胞內源性的蛋白、熱休克蛋白、脂多糖及胞壁酸等。而TLR4作為最早被發現的TLR家族成員，是介導革蘭氏陰性菌脂多糖(lipopeptides，LPS)應答最主要的天然配體，它們不能直接識別結合細菌LPS，但與LPS活化信號的轉導密切相關。同時,其可識別的外源性配體還有植物雙萜紫杉醇、呼吸道合胞體病毒F蛋白(respiratory syncytial virus protein F,RSF)、LTA、乳腺腫瘤病毒包膜蛋白等，內源性配體主要包括由宿主的壞死細胞釋放的熱休克蛋白(heatshockproteins，HSP)、HMGB-1、纖連蛋白(fibronectin，FN)、細胞外基質(extracellular matrixc,ECM) 組分等[8]。

2 TLRs介導的NF-κB信號轉導通路

不同的TLR分子識別配體后與其結合，以配二聚體聚復合物的形式將含TIR的銜接蛋白募集至TIR區，進而根據所募集銜接蛋白的不同，通過啟動細胞內的下游級聯反應，有選擇性的激活相應信號轉導途徑，產生由TLRs介導的各種特異性生物學效應。TLRs因跟相應銜接蛋白的特異性結合而具有各自的特點[9]。Toll樣受體介導的信號通路包括以下不同的轉接蛋白,包括髓樣分化因子88(Myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)、IL-1受體相關蛋白激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)、瘤壞死因子受體相關因子-6(TRAF-6)、MyD88銜接蛋白Mal/TIRAP (MyD88-adapter-like)/(TLR domain-containing adapter protein)、含 TIR 結構域的蛋白誘導干擾素(TIR domain-containing adaptor protein inducing IFN，TRIF)，也叫TIR-containing adapter molecule 1,TICAM1和TRIF相關接頭分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)等[10]。

TLRs與銜接蛋白結合后，胞外信號隨即進入胞內，主要通過兩條途徑啟動下游一系列級聯反應：MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。除TLR3外所有的TLRs介導的信號通路均可通過MyD88 依賴途徑發揮作用，包括TLR-2在內；而TLR4介導的信號通路則同時存在于這兩條單獨的信號途徑，在NF-κB介導的基因感應中被TIRAP啟動聯合MyD88、在第一型干擾素的產生中被TRAM啟動聯合TRIF[11]。而根據信號傳導過程中有無MyD88銜接蛋白的參與而分為MyD88依賴和MyD88非依賴兩種傳導途徑。這兩種信號傳導途徑，最終均需激活NF-κB，引起下游細胞因子分泌，即無論哪種信號傳導途徑,NF-kB都處于下游信號傳導過程的中樞地位。

3 Toll樣受體介導的信號通路在OA進程中發揮重要作用

3.1 Toll樣受體介導的滑膜細胞固有免疫應答是促進OA滑膜炎的關鍵環節 目前，TLRs在如系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風濕性關節炎(rheumatoid Arthrits，RA)和組織損傷等炎癥性疾病中的作用已有明確表述，但還沒有關于其在OA病程進展中作用的系統而直接的論述。OA是以關節軟骨和軟骨下骨損傷、骨贅形成及滑膜炎癥反應為基本病理變化的慢性退行性骨關節病。屬自身免疫性疾病的一種，異常釋放和浸潤的炎癥介質、細胞因子引起滑膜炎癥和骨質的改變，最終導致組織破壞、關節畸形和功能障礙。OA的病程涉及多種免疫細胞及信號通路等的參與，其中，固有免疫系統作為機體防御各種病原體入侵的決定性屏障，通過PRRs識別PAMPs或DAMPs并與之結合后被激活[9]，固有免疫應答反應在誘發和進行性加重OA進程中起著重要的作用。最新研究發現，TLRs作為固有免疫應答系統組成中一類重要的PRRs大家族，其活化后可通過一系列反應廣泛參與識別PAMPs和感知DAMPs，誘導多種炎性介質和因子的合成與釋放，誘發或加重OA[12]，可見，由其介導的固有免疫應答反應是促進OA病程進展的關鍵環節[13]。

3.2 TLRs在OA中的表達 TLRs作為一種PRRs廣泛分布于參與OA病程的各種免疫細胞中，隨著研究的逐漸深入，在越來越多類的非免疫細胞中同樣發現了TLRs的表達。種種證據表明，TLRs的表達與OA的病程進展密切相關，其中，TLR2和TLR4作為TLRs家族的主要成員更是影響OA發生發展的關鍵分子。OA患者在早期階段就有TLR2和TLR4在滑膜組織中表達，盡管其程度較RA相對較輕，但相較正常的滑膜組織而言，其蛋白表達量明顯偏高，同時伴隨著諸如關節疼痛、腫脹、關節腔積液等臨床表現[14]。研究表明，TLRs在OA關節軟骨和滑膜細胞中均有表達。KIM HA等[15]研究證實在骨關節炎軟骨組織中檢測到TLR2、TLR4的表達；RADSTAKE等[16]研究發現,TLR2和TLR4在OA 滑膜組織中存在并大量表達，但正常的滑膜組織中幾乎檢測不到其表達;NAIR A等[17]則在早期OA患者的關節滑液中發現與TLR2、TLR4配體應答相關的顯著增加的滑膜成纖維細胞。上述研究提示TLRs在關節軟骨和滑膜中的表達對OA的進程有著某種重要的意義。

3.3 TLRs的表達與OA病程進展的關系 固有免疫系統不僅起到為宿主防御微生物入侵的作用，還能多種形式的調節組織損傷和修復,包括分別識別特有的PAMPs和DAMPs，均通過激活的PRRs觸發細胞信號轉導，引起促炎性細胞因子和趨化因子的產生，誘發炎癥反應。這些原始的固有免疫炎癥反應被建立用來介導很多急性和慢性型式的組織損傷[18]。這些OA關節的組織退行性變就類似于一種慢性的損傷[19]。一方面,TLRs作為最大的PRRs家族成員之一，觸發信號轉導通路通過包括NF-κB在內的轉錄因子導致炎性基因的表達。另一方面，在OA關節損傷時有些PAMPs或DAMPs(如高遷移率族蛋白-1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、S100鈣粒蛋白家族等)的濃度在關節滑液或組織中增加[20]。這些PRRs和PAMPs、DAMPs在推進滑膜炎癥和軟骨降解的各種能力在不同的動物模型研究中被廣泛的提供信息。每一種在特定的OA表型和不同的OA階段中都發揮著不同的作用。

截至目前為止，TLR2、TLR4在RA患者的表達中已有個別報道。錢雷等[21]發現早期RA患者的外周血單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中TLR2表達增加，而TLR4則下降，推測疾病初期TLR4可能通過促進血管炎癥因子的黏附，后期TLR2通過提高金屬蛋白酶的含量和促進破骨細胞的形成主導者關節破壞作用。熊小泉等[22]通過對不同時期的大鼠PBMC檢測后發現造模15d后，TLR4表達顯著增加，25d后則略有下降，推測15d為RA的活動期，固有免疫系統啟動，而25d后進入穩定期，炎癥因子消退，TLR4mRNA含量明顯降低。然而，對于TLRs在OA進程的報道則少之又少。ZHANG等[23]研究表明TLR2的表達在OA晚期的表達受到明顯抑制。TIMOTHY R等[16]研究發現，滑膜炎癥中期的TLR2表達明顯高于TLR4。QIAN Chen等[24]研究顯示，TLR4的表達與軟骨細胞的凋亡程度呈正相關，并證實TLR4在OA進程中發揮著重要的作用。筆者在前期研究中，通過經典Hulth法建立了大鼠輕、中、重度OA動物模型，在形態學觀察的基礎上研究OA進程的不同時期各組滑膜組織TLR2和TLR4的表達變化，從信號轉導通路出發研究OA滑膜炎癥的發生發展機制，探討 TLRs 與 OA病程進展的相關性。研究結果顯示，TLR2的表達量隨造模時間的延長而逐漸增加，TLR4則有明顯的抑制趨勢，NF-κB表達持續增加。這與上述文獻中所闡述的研究結果基本吻合。推測其可能的機制為：隨OA的病程進展，壞死細胞數量增多，更多TLR2配體被釋放。而早期的OA中，TLR4活化引發一系列的炎癥反應，固有免疫系統啟動，機體的保護性反應被觸發，進而反饋性的對TLR4的活化起到了抑制作用，使其表達逐漸下降。以上研究進一步表明了TLRs介導的炎癥通路與OA的病例進程的相關性。

TLRs及其介導的信號通路參與了OA發生發展全過程，在組織修復和關節結構破壞上起到不可忽視作用。因而，隨著對OA發病和進展機制及TLRs作用了解的逐漸深入，試圖以TLRs及其相關配體、介導的信號通路上MyD88、NF-κB等元件和下游炎性介質等為靶點，通過對其的干預最終達到對OA的緩解甚至治愈的目的，成為OA預防及治療的新趨勢。

[1]GORANOV N V.Serum markers of lipid peroxidation,antioxidant enzymatic defense,and collagen degradation in an experimental (Pond-Nuki) canine model of osteoarthritis[J].Veterinary Clinical Pathology,2007,36(2):192-195.

[2]SCANZELLO C R,PLAAS A,CROW M K.Innate immune system activation in osteoarthritis:is osteoarthritis a chronic wound?[J].Current Opinion in Rheumatology,2008,20(5):565-572.

[3]ADEREM A,ULEVITCH R J.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature,2000,406(6797):782-787.

[4]LEMAITRE B,NICOLAS E,MICHAUT L,et al.Pillars article:the dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.Cell.1996.86:973-983[J].Journal of Immunology,2012,188(11):5210-5220.

[5]MEDZHITOV R,PRESTON-HURLBURT P,JANEWAY C A.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J].Nature,1997,388(6640):394-397.

[6]KAWAI T,AKIRA S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nature Immunology,2010,11(5):373-384.

[7]REUVEN E M,FINK A,SHAI Y.Regulation of innate immune responses by transmembrane interactions:Lessons from the TLR family[J].Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes,2014,1838(6,SI):1586-1593.

[8]SINGH B P,CHAUHAN R S,SINGHAL L K,et al.Toll-like receptors and their role in innate immunity[J].Currentence,2003,85(8):1156-1164.

[9]YAMAMOTO M,TAKEDA K,AKIRA S.TIR domain-containing adaptors define the specificity of TLR signaling[J].Molecular Immunology,2004,40(12):861-868.

[10]GAY N J,GANGLOFF M.Structure and function of Toll receptors and their ligands[J].Annual Review of Biochemistry,2007,76(1):141-165.

[11]TAKEDA K,KAISHO T,AKIRA S.Toll-like receptors[J].Annual Review of Immunology,2015,21(1):335-376.

[12]WILLCOCKS S,OFFORD V,SEYFERT H M,et al.Species-specific PAMP recognition by TLR2 and evidence for species-restricted interaction with Dectin-1[J].Journal of Leukocyte Biology,2013,94(3):449-458.

[13]REYNOLDS J M,DONG Chen.Toll-like receptor regulation of effector T lymphocyte function[J].Trends in Immunology,2013,34(10):511-519.

[14]SELLAM J,BERENBAUM F.The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis[J].Nature Reviews Rheumatology,2010,6(11):625-635.

[15]KIM H A,CHO M L,CHOI H Y,et al.The catabolic pathway mediated by Toll-like receptors in human osteoarthritic chondrocytes[J].Arthritis&Rheumatism,2006,54(7):2152-2163.

[16]TIMOTHY R.D.J.RADSTAKE MD PHD,ROELOFS M F,JENNISKENS Y M,et al.Expression of toll-like receptors 2 and 4 in rheumatoid synovial tissue and regulation by proinflammatory cytokines interleukin-12 and interleukin-18 via interferon-gamma.[J].Arthritis & Rheumatism,2004,50(12):3856-3865.

[17]NAIR A,KANDA V,BUSH-JOSEPH C,et al.Synovial fluid from patients with early osteoarthritis modulates fibroblast-like synoviocyte responses to Toll-like receptor 4 and Toll-like receptor 2 ligands via soluble CD14[J].Arthritis&Rheumatology,2012,64(7):2268-2277.

[18]CUNHA C,CARVALHO A,ESPOSITO A A,et al.DAMP signaling in fungal infections and diseases[J].Frontiers in Immunology,2012(3):286.1-6.

[19]LIU-BRYAN R.Synovium and the innate inflammatory network in osteoarthritis progression[J].Current Rheumatology Reports,2013,15(5):1-7.

[20]SCANZELLO C R,GOLDRING S R.The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis[J].Bone,2012,51(2,SI):249-257.

[21]錢雷,汪曉鶯,呂麗君,等.類風濕性關節炎患者早期外周血單個核細胞Toll樣受體2、4表達及意義[J].檢驗醫學,2012,27(8):659-662.

[22]熊小泉,石文,黃憲章.TLR4介導的固有免疫在類風濕關節炎模型大鼠發病過程中的意義[J].廣東醫學,2009,30(10):1471-1473.

[23]ZHANG Qian,HUI Wang,DAVIDSON R,et al.Differential toll-like receptor-dependent collagenase expression in chondrocytes[J].Arthritis Research & Therapy,2007,9(S3):1633-1641.

[24]錢臣,卞曉星.Toll樣受體4表達與膝骨關節炎軟骨細胞凋亡的關系[J].江蘇大學學報(醫學版),2015,25(2):128-132.

Toll-like receptors in osteoarthritis

WANG Huan1,WANG Qingfu2*,YIN Yueshan2,ZHANG Dong1,WANG Weili1,DING Haobin1,GUO Yuru1,DU Wangyang1,GAN Wen1,XU Mingkang1

(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Toll-like receptors (TLRs) are important members of pattern recognition receptors (PRRs) in body's natural immune system,which can trigger myeloid differentiation factor 88 (MyD88)dependent pathway or MyD88 independent pathway that actives NF-κB and lead to the secretion of cytokines and inflammatory mediators by identified pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and endogenous damage associated molecular patterns (DAMPs) recognition.Then start the natural immune response,play an important role in the process of osteoarthritis (OA).Explore TLR family molecules and NF-κB pathway in OA can provide a theoretical basis for the further study of the mechanism and prevention and treatment in OA.

Toll-like receptor;knee osteoarthritis;NF-κB signal passway

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.058

國家自然科學基金面上項目(81373662)；北京中醫藥大學自主選題項目(2014-JYBZZ-XS-171)。

王 歡(1986-)，女，博士研究生。

R274.9

A

2095-6258(2016)06-1265-04

輯：張 忠

2016-01-16)

*通信作者：王慶甫，男，教授，電話-(010)52075209，電子信箱-qingpu-wang@sohu.com