肝癌HSV-TK/GCV自殺基因治療的研究進展*

田海飛 綜述，曾　燕 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院放射科　400010)

?

·綜述·

肝癌HSV-TK/GCV自殺基因治療的研究進展*

田海飛 綜述，曾燕△審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院放射科400010)

肝腫瘤；基因療法；基因,轉基因,自殺；單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羥甲基無環鳥苷

GCV是一種用于抗病毒感染的藥物，HSV-TK基因表達的胸苷激酶能將GCV磷酸化成GCV-TP取代DNA合成過程中的鳥嘌呤-5′-三磷酸，成為DNA合成的競爭性抑制劑，抑制 DNA鏈延長，通過誘導凋亡機制引起細胞死亡[1]。其誘導細胞凋亡的機制還與激活P53通路、線粒體損傷、細胞毒作用等相關。HSV-TK/GCV系統介導細胞毒作用中存在不可修復的雙鏈DNA斷裂，抑制基因的同源修復能夠顯著增強HSV-TK/GCV系統的細胞毒作用[2]。此外讓轉染了HSV-TK基因的細胞和TK基因陰性細胞共培養，給予GCV后不僅HSV-TK基因陽性細胞死亡，TK基因陰性細胞也發生死亡，這種現象為旁觀者效應。旁觀者效應的產生機制與細胞間存在物質交換相關,其中最重要的機制是細胞縫隙連接，一些對細胞縫隙連接形成起促進作用的藥物如丹參酮ⅡA等可以使旁觀者效應明顯增強[3]。HSV-TK/GCV系統通過直接殺細胞作用和旁觀者效應顯現出良好的抗腫瘤作用，被廣泛用于各種腫瘤的治療研究。

1　HSV-TK基因的載體

HSV-TK基因要進入腫瘤細胞正常表達產生相應的酶，需要載體協助穿透腫瘤細胞生物膜，基因載體的選擇對基因治療系統的安全和效率至關重要。

1.1病毒載體大多數病毒可通過逆轉錄作用將自身基因整合到宿主細胞遺傳物質中進行繁殖，病毒具有高效的轉染率，但是病毒載體中常常存在與病毒自身復制及表達病原性物質相關的基因，存在一些潛在的危險因素，潛在生物安全隱患是病毒載體成為HSV-TK基因載體運用于人體的主要限制因素。目前，研究較多的病毒載體有腺病毒、逆轉錄病毒、腺病毒相關病毒、慢病毒載體等，這些病毒載體都存在各自的缺陷，但隨著基因重組技術應運而生的重組病毒載體又給病毒載體帶來新的生機。

1.1.1腺病毒腺病毒對動物肝臟細胞有明顯嗜性，而且腺病毒載體不具細胞周期性，同時腺病毒載體可以產生較高的病毒滴度，其嗜肝性、高效性、高滴度性使腺病毒載體成為肝癌HSV-TK系統的首選載體之一。腺病毒載體歷經三代發展，具較高免疫原性的第一、二代腺病毒載體已被失去大部分甚至是全部腺病毒基因只保留了反向末端重復區及包裝信號序列的第三代腺病毒載體取代[4]。但是腺病毒的嗜肝性能對腫瘤細胞之外正常肝臟組織細胞產生額外的嚴重損傷作用，因此在利用其高效性時還要限制其對正常肝細胞的毒性作用。mir122基因是含量最多的肝細胞特異性的微小RNA，具有調控基因表達的作用，研究表明在50%～70%的人原發性肝癌和肝癌細胞株系列中mir122存在顯著的減少[5]，因此有學者將mir122基因的mir122T序列插入TK基因的3′非翻譯區，構建了載mir122+TK基因的腺病毒載體，體外及小鼠原位肝癌模型實驗表明，該載體能夠有效保護HSV-TK/GCV系統對mir122高表達的正常肝細胞的殺傷作用，而不會削弱HSV-TK/GCV系統的抗腫瘤作用[6]，實現了腺病毒載體的高效和安全的統一。

1.1.2逆轉錄病毒逆轉錄病毒能將自身基因整合到宿主遺傳物質中實現在宿主細胞中的持續表達，具有相對穩定性，但逆轉錄病毒具有細胞周期性，只顯示出對處于活躍復制、分裂期細胞的感染作用，因此逆轉錄病毒載體的轉錄效率及體內病毒滴度低，這使得常規逆轉錄病毒載體運用受限。小鼠慢性白血病病毒MLV相關逆轉錄病毒在3′非翻譯區含有轉座子基因，該基因能夠在不侵入正常細胞的情況下穩定的傳播到處于不同感染周期的實體腫瘤細胞中[7]，Lai等[8]用乙型肝炎病毒增強子Ⅱ和人類肝細胞甲胎蛋白(AFP)啟動子管制區替代MLV的U3區域的長末端重復序列，構建了肝癌特異性逆轉錄病毒載體RRV，證實這種重組逆轉錄病毒載體能顯著提高肝癌細胞的特異性轉錄水平，并且具有肝癌細胞特異性。

1.2非病毒載體非病毒載體種類繁多，包括間充質干細胞、陽離子聚合物、納米粒、肽類、細菌類和真核細胞類質粒等。就載體安全性而言，非病毒載體比病毒載體更具優勢，但常規的非病毒載體缺乏組織特異性和靶向性，容易被網狀內皮系統清除，具有染效率較低的缺點，新的載體材料的發現和修飾技術的運用讓非病毒載體成為較病毒載體更具前景的基因載體。

1.2.1間充質干細胞間充質干細胞具有良好的遷移性及腫瘤組織趨向性，近期研究表明間充質干細胞能高效地運輸治療基因到腫瘤細胞中長期穩定地表達，是一種新的集安全高效為一體的基因載體[9]，Nouri等[10]用間充質干細胞作為4種不同自殺基因治療系統的載體均表現出高效的轉染率和殺腫瘤細胞作用，同時該研究還表明間充質干細胞還可用于評估不同自殺基因治療系統的治療效果，并可對自殺基因治療的前藥進行臨床前的篩選。

1.2.2納米粒載體納米粒因其體積小，容易穿過血管內皮細胞，并且具有抗核酸酶作用而備受親睞，同時納米粒可根據需要連接不同分子探針及藥物實現影像顯像和靶向治療等多種功能。Alqahtani等[11]用糖聚殼修飾聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米粒，該納米粒表現出良好的細胞親和性，較低的細胞毒性，并且具有抗氧化作用。如果將HSV-TK基因包裹在這種直徑小于700 nm的納米粒中，并在納米粒上連接單克隆抗體等靶向物質，能夠讓載基因納米粒具有主動尋靶功能并能輕易透過血管內皮間隙到達細胞間隙，與細胞的接觸時間增長，獲得更高的轉染率。

2　增效策略

治療效率較低也是限制基因治療發展和運用的主要因素，以下策略有望提高HSV-TK/GCV系統的治療效率。

2.1提高基因轉染效率治療基因成功轉染腫瘤細胞是基因治療的第一步，實現腫瘤細胞靶向轉染、延長基因與細胞的接觸時間、增加細胞膜的通透性等都是提高轉染效率的有效途徑。景周宏等[12]構建了肝癌細胞 GPC3 抗體的納米分子探針，該分子探針可特異性結合肝癌細胞，達到靶向性識別效果，有效提高基因轉染效率。利用納米粒體積小、體內的循環時間長的優勢，Zhang等[13]發現用二價陽離子修飾硅納米顆粒表面后，該納米粒不僅能與DNA結合，并且結合在顆粒上的DNA能抵抗DNA酶的酶解作用，故將硅顆粒與脂質體混合后與DNA一起轉染細胞，發現用二價陽離子修飾后的納米粒載體基因轉染效率顯著提高。還有實驗證明超聲微泡靶向爆破系統利用其空化及聲孔效應，能增加細胞膜的通透性提高轉染率[14]。

2.2提高基因的轉錄效率在自殺基因上連接腫瘤特異性的啟動子、增強子等轉錄作用原件，增強治療基因在腫瘤細胞中的表達，增加基因表達產物水平，提高GCV的磷酸化水平，增加細胞毒性藥物濃度。Lai等[15]構建了含AFP啟動子的重組質粒載體pAFP-HSVtk-IRES2-EGFP,用該重組質粒來轉染肝癌HEPG2細胞，檢測HSV-TK基因表達產物，數據表明AFP陽性組明顯高于AFP陰性對照組。

2.3增強HSV-TK基因表達產物與GCV的敏感性和親和力不同類型胸腺激酶基因表達的產物對GCV的磷酸化作用效率存在差異，選擇對GCV更具親和力的基因型以增加GCV的磷酸化效率，研究表明馬單純皰疹病毒4型(EHV4-TK)突變型基因較其他類型胸腺嘧啶激酶基因與GCV的親和性更高，能優先磷酸化GCV，終止DNA的延長，增加GCV對腫瘤細胞的毒性作用[15]。

2.4融合基因腫瘤的發生、發展、轉移涉及多個基因的改變，只用更全面解決腫瘤細胞基因改變引起的變化，才能取得更高效的治療效果。利用基因重組技術將不同治療基因連接在一起,例如雙自殺基因CD-TK融合基因，自殺基因-免疫基因重組、自殺基因-抑癌基因重組等。Higashi等[16]構建了含人端粒酶逆轉錄增強子序列的IL-18融合HSV-TK基因的載體，用于治療小鼠結腸癌模型，實驗數據表明IL-18融合HSV-TK基因能引起特異性免疫反應，較單基因有更佳的治療效果。

2.5增強旁觀效應旁觀者效應能明顯增加HSV-TK/GCV系統的殺腫瘤細胞作用，增強旁觀者效應，特別是遠隔旁觀者效應能有效抑制腫瘤的生長和遠處轉移，通過調節與旁觀者效應作用機制相關的因素可達到增強旁觀者效應。如運用促進細胞縫隙連接的藥物；增加磷酸化GCV的流出效應等，此外最新研究發現輻射能誘導旁觀者效應，影響輻射誘導旁觀者效應的因素包括自由基、免疫系統炎癥通路、表觀遺傳等[17]。

2.6聯合治療單純自殺基因治療由于轉染效率較低等多方面原因效果欠佳，基因治療聯合其他治療方式成為解決這一問題的主要方案之一。如自殺基因治療聯合放射治療，研究表明轉染了自殺基因的腫瘤細胞對放射治療的具有更高的敏感性。Kawashita等[18]用腺病毒Flt3L配體基因療法+Egr-TK/GCV+放射治療、Flt3L配體基因療法+放射治療及以上3種治療方式單一治療小鼠肝癌，實驗結果顯示，腺病毒Flt3L配體基因療法+Egr-TK/GCV+放射治療具有最佳的治療效果。自殺基因治療聯合局部高強度聚焦超聲(HIFU)治療，HIFU是應用超聲波可聚焦和穿透性，短時間內使靶區組織溫度達到 65～100 ℃，使靶組織造成凝固性壞死的一種新的無創性治療腫瘤的方法，李紅陽等[19]采用HSV-TK/GCV系統聯合HIFU治療裸鼠肝癌移植瘤，聯合治療組裸鼠腫瘤大小明顯小于單一治療組，聯合治療組荷瘤鼠生存時間高于單一治療組。

2.7實時動態監控探索HSV-TK基因在細胞內的行為機制對提高HSV-TK/GCV治療系統的安全和效率至關重要，分子影像是實現基因的運輸和在細胞內功能動態變化可視化的一個強大工具。Shao等[20]利用量子點技術在TK基因和遠紅外熒光量子點之間構建共價鍵對TK基因進行標記，這個標記既不會影像量子點的遠紅外熒光效應，又不會影像TK基因的生物功能，實現了對HSV-TK/GCV系統在體內、體外的作用過程的實時動態的可視化追蹤，并發現這種量子點不僅可以實時追蹤，還能控制管理HSV-TK/GCV的效率，這為提高肝癌HSV-TK/GCV基因治療的安全性及效率及個體化治療提供了可視化的依據。

基因治療將是肝癌等惡性腫瘤非手術治療的主導方向，具有巨大研究和發展空間，要想基因治療能夠運用于臨床，造福于腫瘤患者，仍有許多限制因素需要解決，首先需要研發出集安全、高效、穩定、靶向于一體的新型基因載體，不管是病毒載體還是非病毒載體，隨著不斷完善和改量，都有可能成為基因治療的最佳載體。此外自殺基因聯合治療是解決單一自殺基因療效欠佳的解決方向；而旁觀者效應是一把雙刃劍，如何能更好地掌控旁觀者效應使之能夠最大限度地殺死腫瘤細胞而更少的損傷正常細胞是需要不斷探索的內容。同時一些新的治療評價方法也需要被不斷完善，為自殺基因治療提供正確和準確的指導，相信隨著研究的不斷深入，肝癌的治愈指日可待。

[1]Cheng YC,Grill SP,Dutschman GE,et al.Metabolism of 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl) guanine,a new anti-herpes virus compound,in herpes simplex virus-infected cells[J].J Biol Chem,1983,258(20):12460-12464.

[2]Ladd B,O′Konek JJ,Ostruszka LJ,et al.Unrepairable DNA double-strand breaks initiate cytotoxicity with HSV-TK/ganciclovir[J].Cancer Gene Ther,2011,18(10):751-759.

[3]Xiao J,Zhang G,Qiu P,et al.Tanshinone IIA increases the bystander effect of herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy via enhanced gap junctional intercellular communication[J].PloS One,2013,8(7):e67662.

[4]Sviatchenko VA,Tarasova MV,Netesov SV,et al.Oncolytic adenoviruses in anti-cancer therapy:current status and perspectives[J].Mol Biol (Mosk),2011,46(4):556-569.

[5]Li C,Wang Y,Wang S,et al.Hepatitis B virus mRNA-mediated miR-122 inhibition upregulates PTTG1-binding protein,which promotes hepatocellular carcinoma tumor growth and cell invasion[J].J Virol,2013,87(4):2193-2205.

[6]Wang G,Dong X,Tian W,et al.Evaluation of miR-122-regulated suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma in an orthotopic mouse model[J].Chin J Cancer Res,2013,25(6):646-655.

[7]Logg CR,Tai CK,Logg A,et al.A uniquely stable replication-competent retrovirus vector achieves efficient gene delivery in vitro and in solid tumors[J].Hum Gene Ther,2001,12(8):921-932.

[8]Lai YH,Lin CC,Chen SH,et al.Tumor-specific suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma by transcriptionally targeted retroviral replicating vectors[J].Gene Ther,2015,22(2):155-162.

[9]Yang K,Xu WG,Liu YZ,et al.Study on the effect of BMSCs-EGFP-tk as mediator of HSV1-tk/GCV suicide gene therapy directed against A549 in vitro[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(9):3080-3086.

[10] Nouri FS,Wang X,Hatefi A.Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems[J].J Control Release,2015(200):179-187.

[11]Alqahtani S,Simon L,Astete CE,et al.Cellular uptake,antioxidant and antiproliferative activity of entrapped α-tocopherol and γ-tocotrienol in poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and chitosan covered PLGA nanoparticles (PLGA-Chi)[J].J Colloi Interf Sci,2015(445):243-251.

[12]景周宏,何承俊,潘萬龍,等.載肝癌細胞 GPC3 抗體的納米級脂質超聲微泡制備及體外尋靶研究[J].重慶醫科大學學報,2013,38(5):449-453.

[13] Zhang TY,Huang B,Yuan ZY,et al.Gene recombinant bone marrow mesenchymal stem cells as a tumor-targeted suicide gene delivery vehicle in pulmonary metastasis therapy using non-viral transfection[J].Nanomedicine,2014,10(1):257-267.

[14]Hao Y,Guo L,Abudula A,et al.Proliferation inhibition and apoptosis enhancement of human cervical cancer cells by ultrasound-targeted microbubble destruction delivered double suicide genes[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(12):5330-5335.

[15]Lai Z,Qin Q,Yu B,et al.Construction of plasmid vector pAFP-HSVtk-IRES2-EGFP and its effect on the cytotoxicity of ganciclovir to hepatocellular carcinoma[J].Chin Med J (Engl),2014,127(12):2337-2341.

[16]Higashi K,Hazama S,Araki A,et al.A novel cancer vaccine strategy with combined IL-18 and HSV-TK gene therapy driven by the hTERT promoter in a murine colorectal cancer model[J].Int J Oncol,2014,45(4):1412-1420.

[17] Najafi M,Fardid R,Hadadi G,et al.The Mechanisms of Radiation-Induced Bystander Effect[J].J Biomed Phys Eng,2014,4(4):163-172.

[18]Kawashita Y,Deb NJ,Garg M,et al.An autologous in situ tumor vaccination approach for hepatocellular carcinoma.1.Flt3 ligand gene transfer increases antitumor effects of a radio-inducible suicide gene therapy in an ectopic tumor model[J].Radiat Res,2014,182(2):191-200.

[19]李紅陽,周世驥,劉長安,等.不同濃度載 HSV1-TK 基因的超聲靶向微泡造影劑對 HIFU 治療后裸鼠肝癌的影響[J].中國醫科大學學報,2013,42(1):31-34.

[20]Shao D,Li J,Xiao X,et al.Real-time visualizing and tracing of HSV-TK/GCV suicide gene therapy by near-infrared fluorescent quantum dots[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(14):11082-11090.

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.038

重慶市衛生局重點項目(2013-1-021)。作者簡介：田海飛(1988-),在讀碩士，主要從事腹部影像學研究。△

，E-mail:751403669@qq.com。

A

1671-8348(2016)12-1697-04

2015-12-22

2016-01-19)