山茱萸多糖對(duì)衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)的影響*

王愛梅，陳亞奇，李　旻，王　方，未小明，張　廷，劉洪恩

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南南陽 473061)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

山茱萸多糖對(duì)衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)的影響*

王愛梅，陳亞奇，李旻，王方，未小明，張廷，劉洪恩

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南南陽 473061)

目的觀察山茱萸多糖對(duì)衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬腦源性生長因子(BDNF)、酪氨酸激酶B受體(TrkB) mRNA表達(dá)的影響。方法清潔級(jí)SD大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組10只。采用D-半乳糖皮下注射構(gòu)建大鼠衰老模型，避暗實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力，逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測海馬BDNF和TrkB mRNA表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組潛伏期明顯降低，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，平均逃避潛伏期明顯延長，探索次數(shù)明顯減少，海馬BDNF和TrkB mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。低、高劑量組與模型組比較潛伏期明顯增高，錯(cuò)誤次數(shù)明顯降低，平均逃避潛伏期明顯縮短，探索次數(shù)明顯增加，海馬BDNF和TrkB mRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論山茱萸多糖能提高衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，可能與增加衰老模型大鼠海馬BDNF和TrkB mRNA的表達(dá)有關(guān)。

山茱萸多糖；衰老；記憶障礙；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；蛋白酪氨酸激酶B

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥果肉，又名山萸肉、藥棗、蜀棗、雞足、肉棗等，是我國常用名貴中藥材，具有補(bǔ)肝腎、澀精氣、固虛脫之功效，主要用于治療腰膝酸痛、陽痿遺精、崩漏帶下、眩暈耳鳴等[1]。山茱萸多糖是山茱萸生物學(xué)活性物質(zhì)的重要成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫[2]等多種藥理作用。但山茱萸多糖對(duì)衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的作用及機(jī)制則少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以皮下注射D-半乳糖方法構(gòu)建大鼠衰老模型，觀察山茱萸多糖對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬腦源性生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受體酪氨酸激酶B受體(tyrosine kinase B receptor,TrkB)mRNA表達(dá)的影響，為該藥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(220±20)g，雌雄各半，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002]。飼養(yǎng)室溫20 ℃，自由進(jìn)食飲水，自然晝夜節(jié)律光照。

1.1.2藥物及試劑D-半乳糖，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130812；山茱萸多糖，寧波德康生物制品有限公司，批號(hào)20130710；RT-PCR引物、溴化乙錠，上海生工生物工程有限公司，批號(hào)分別為20130625、20130515；DNA Marker，F(xiàn)ermentas公司，由大連寶生物工程有限公司分裝，批號(hào)20130811；AMV cDNA第一鏈合成試劑盒、即用型PCR擴(kuò)增試劑盒，由大連寶生物工程有限公司，批號(hào)分別為20130504、20130512；焦碳酸二乙酯、Trizol、瓊脂糖，加拿大BBI公司，由大連寶生物工程有限公司分裝，批號(hào)分別為20121208、20130407、20130212。

1.1.3儀器大鼠避暗儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，Morris水迷宮(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，Hema TGL-18R型冷凍離心機(jī)、Hema 480 PCR儀(珠海黑馬醫(yī)療儀器有限公司)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)，UV240IPC紫外分光光度儀(日本島津公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組10只。模型組、低劑量組和高劑量組大鼠每天頸背部皮下注射140 mg/kg D-半乳糖，對(duì)照組大鼠每天頸背部皮下注射等量生理鹽水1 mL，連續(xù)6周；低劑量組和高劑量組大鼠從第1天開始分別給予0.14、0.28 g/kg山茱萸多糖灌胃，均為1次/d，連續(xù)6周，對(duì)照組和模型組大鼠每天給予等量的生理鹽水2 mL灌胃，連續(xù)6周。各組動(dòng)物每周記錄1次體質(zhì)量，調(diào)整注射劑量。

1.2.2大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定

1.2.2.1避暗實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)前，先將動(dòng)物放入避暗箱中適應(yīng)環(huán)境3 min，然后接通銅柵電源，將大鼠放入明室(背對(duì)洞口)，因天生具有嗜暗習(xí)性大鼠會(huì)穿過圓孔進(jìn)入暗室，在暗室遭到電擊后返回明室，從而獲得暗箱遭受電擊記憶，如此反復(fù)訓(xùn)練幾次。24 h后開始測試，記錄大鼠潛伏期(從放入至第1次遭電擊的時(shí)間)和5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(大鼠遭電擊次數(shù))來檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。如果5 min內(nèi)大鼠未進(jìn)入暗室，則潛伏期記為300 s，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次[3]。

表1　　各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s，n=10)

a:P<0.01，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較；d:P<0.05，e:P<0.01，與低劑量組比較。

1.2.2.2Morris水迷宮Morris水迷宮測試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)[4-6]。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 d，每只動(dòng)物訓(xùn)練每天2次。將大鼠面向池壁由4個(gè)入水點(diǎn)放入池中，從入水到找到隱藏平臺(tái)所需時(shí)間 (即逃避潛伏期)，檢測大鼠學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力，取實(shí)驗(yàn)第4、5天逃避潛伏期，計(jì)算其均數(shù)。記錄120 s內(nèi)搜索平臺(tái)的路線圖以確定其搜索策略。Morris水迷宮測試第6天，移除水下隱藏平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠120 s內(nèi)穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)(即探索次數(shù))，考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。

1.2.3大鼠海馬組織BDNF、TrkB mRNA逆轉(zhuǎn)錄半定量檢測無RNA酶條件下取大鼠一側(cè)海馬組織立即投入液氮罐中保存，取出研磨組織，用Trizol法提取總RNA，檢測純度。按AMV cDNA第一鏈試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上下游引物。BDNF 引物(產(chǎn)物長度為285 bp)，正向引物5′-TTA TTT CAT ACT TCG GTT GC-3′，反向引物5′-AAG GCA CTT GAC TGC TGA-3′；TrkB引物(產(chǎn)物長度為439 bp):正向引物5′-GTT CTA CAA CGG AGC CAT AC-3′，反向引物5′-CAT GCC AAA CTT GGA ATG T-3′。β-actin引物(產(chǎn)物長度為138 bp)：正向引物5′-TTA CTG CCC TGG CTC CTA-3′，反向引物5′-CGT ACT CCT GCT TGC TGA TC-3′。按即用型PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件BDNF：94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s、58.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30循環(huán)；72 ℃ 5 min。TrKB：94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30循環(huán)；72 ℃ 5 min。β-actin：94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30循環(huán)；72 ℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，紫外光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝像、分析。以目的基因光密度值/β-actin光密度值表示目的基因mRNA 表達(dá)水平。

2　結(jié)　　果

2.1山茱萸多糖對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組的潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.01)；與模型組相比，低、高劑量組潛伏期明顯延長，錯(cuò)誤次數(shù)顯著降低(P<0.05，P<0.01)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組逃避潛伏期明顯延長、探索次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，低、高劑量組逃避潛伏期明顯縮短，探索次數(shù)明顯增多(P<0.05，P<0.01)，見表1。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡類型分為4種：趨向型、直線型、隨機(jī)型、邊緣型。每只大鼠5 d共游泳10次，對(duì)比各組大鼠游泳軌跡，對(duì)照組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡分別為38次和44次，模型組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡分別為25次、15次，兩組間運(yùn)動(dòng)軌跡相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，低、高劑量組大鼠游泳軌跡類型趨向型和直線型有所提高，隨機(jī)型和邊緣型明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見表2。

表2　　大鼠Morris水迷宮游泳軌跡類型(n，n=10)

a:P<0.01，與對(duì)照組比較；b:P<0.01，與模型組比較。

2.2山茱萸多糖對(duì)各組大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)的影響模型組海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，而低、高劑量組海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)則明顯高于模型組(P<0.01)，其中以高劑量組表達(dá)升高最顯著(P<0.01)。見圖1、表3。

A:BDNF;B：TrkB。

圖1　山茱萸多糖對(duì)各組大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)的影響(電泳圖)表3　　山茱萸多糖對(duì)各組大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)的影響

a:P<0.01，與對(duì)照組比較；b:P<0.01，與模型組比較；c:P<0.01，與低劑量組比較。

3　討　　論

衰老是一種復(fù)雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)、機(jī)體功能衰退及適應(yīng)性能力、抵抗力下降。大腦記憶能力的減退，是衰老早期癥狀之一[7]。近年來，隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，一些因老齡化所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降的老年患者逐漸增多，與記憶能力相關(guān)的老年疾病的研究也越來越多，中醫(yī)藥在衰老的預(yù)防、保健、治療與康復(fù)等方面有顯著的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：衰老主要是由腎虛導(dǎo)致的[8]，山茱萸有補(bǔ)益肝腎之功效，符合衰老中醫(yī)學(xué)治療理論。在臨床上，抗衰老的藥物大多只是對(duì)癥治療，缺乏治療的有效性。中醫(yī)藥治療衰老的優(yōu)勢在于全面動(dòng)員機(jī)體自身的調(diào)理功能，著重于促進(jìn)神經(jīng)元自身結(jié)構(gòu)和功能的改善。目前在抗衰老的藥物研究中，中藥單體及有效成分緩解衰老的研究進(jìn)展較快[9]，這些實(shí)驗(yàn)為尋找抗衰老藥物提供了很好的思路和方法。

避暗實(shí)驗(yàn)是用來檢測大、小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)檢測方法[10]。Morris水迷宮是用于測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)測定方法，能較好反映動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的形成和維持，是記憶量化的良好測定方法[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組相比，山茱萸多糖低、高劑量組大鼠潛伏期明顯延長，錯(cuò)誤次數(shù)明顯降低，逃避潛伏期明顯縮短，探索次數(shù)明顯增加，表明山茱萸多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙具有良好的改善作用。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是哺乳動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶形成的重要結(jié)構(gòu)和功能區(qū)，在衰老過程中海馬神經(jīng)元的易損性是學(xué)習(xí)記憶退化的重要原因[9,12]。根據(jù)檢測分析,海馬是BDNF和TrkB表達(dá)最為豐富的腦區(qū)，而海馬又是學(xué)習(xí)記憶的核心結(jié)構(gòu)，因而對(duì)BDNF與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究集中在海馬[13]。BDNF是腦內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子[14]，TrkB是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經(jīng)營養(yǎng)素家族高親和力受體，是BDNF的特異性受體，BDNF 的作用必須通過與TrkB 結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用[15]，可以促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)、維持神經(jīng)元的生長及促進(jìn)再生、參與學(xué)習(xí)記憶過程，BDNF及TrkB缺乏或功能異常可伴有嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，經(jīng)過山茱萸多糖干預(yù)后，海馬BDNF、TrKB mRNA表達(dá)明顯升高，說明山茱萸多糖可能通過上調(diào)BDNF、TrkB mRNA表達(dá)而改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，山茱萸多糖具有抗衰老作用，此作用可能與上調(diào)海馬BDNF、TrkB mRNA 的表達(dá)有關(guān)。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.031

南陽市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2012GG056)。作者簡介：王愛梅(1973-)，副教授，碩士，主要從事中藥抗衰老研究。

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1671-8348(2016)12-1680-03

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2016-01-21)