茶葉化學成分樣品制備的優化方法

張曉衛（洛陽市質量技術監督檢驗測試中心，河南洛陽471003）

?

茶葉化學成分樣品制備的優化方法

張曉衛
（洛陽市質量技術監督檢驗測試中心，河南洛陽471003）

摘要：以指紋識別要求為基礎，結合1H NMR以及主成分分析（PCA）兩種方法分別作為測試以及評估手段，深入研究了對茶葉中化學成分樣品制備優化方法。以生物指紋為手段，對化學組分和樣品體系多而復雜的特點進行識別，以主成分分析為手段綜合分析了樣品質控多方面的因素，最后對實驗條件進行確立。在樣品制備程序基礎上，采取4種代表性茶葉分別展開預處理以及測試。實踐結果表明，本文所述方法不僅穩定，而且可靠性較好，與1H NMR要求相吻合。本文中所提優化方法操作簡單，即使樣品體系復雜也同樣適用。

關鍵詞：茶葉；化學成分；樣品制備；優化方法

在生物學研究領域，指紋技術發揮著不可替代的作用，隨著該技術的不斷完善，也逐漸得到了大家普遍關注。代謝組學在近年來的興起為該技術繼續發展提供了重要支撐。Fiehn等人在進行植物樣品標準化處理上，將其代謝物做到了“全提取”生成1H NMR譜，將主成分分析法等方法結合進來，以此來分析所得1H NMR譜。本文以“代謝物指紋識別”作為研究思路進行篩選。1H NMR具有快速、獲取內容豐富等特點，PCA能夠對大量信息展開整體性分析。因此在本文研究中，引入此方法既簡化了操作步驟，又保證了最大程序獲取和利用內涵信息。

1　實驗步驟

1.1儀器以及試劑的選擇

核磁譜儀；數控超聲波清洗器；天平；數據處理軟件；氘代甲醇；重水；3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉；磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉重水緩沖溶液，pH值控制在7.4，取部分加入TSP-d4作內標基準試劑用。

1.2具體過程

根據參考資料以及多年工作經驗，本次實驗采用的預處理方法是超聲提取。采用四個樣品分別是曬青毛茶（編號為T1）、寧洱困蘆山古茶（編號為T2）、普洱茶（編號為T3）以及人參烏龍茶（編號為T4）。分別取出4種茶葉，研磨成粉末并過篩處理；取定量粉末浸泡于配置好的溶劑中，經過一段時間的控溫超聲之后，將其冷卻離心處理，在核磁管中加入400μL上清液，取10μL基準試劑加入其中待測。這樣做能夠使體系pH值保持恒定，并且能夠提供內標參考峰。

1.3獲取1H NMR譜

選取脈沖序列，其中譜寬設置為6000 Hz，弛豫延遲設置為2s，混合時間設置為150ms，采樣點數32K，掃描次數為256次，得出1H NMR后，利用Fouier進行變換、相位以及基線校正，將甲基質子信號峰值位移定位成零，化學位移定標，整個實驗步驟都在恒溫狀態下完成。

1.4PCA

該方法是一種數據線映射方法，實現了對多元變量數據的統計處理。它能夠最大限度將原有信息保留下來，把樣本從高維空間狀態下映射到低維空間狀態下。PCA思路：利用少量變量解釋原始數據中包含的大量信息，對相關性較高的變量進行處理，轉化成不相關或者獨立新變量，我們所說的主成分指的就是這些新變量。PCA的本質就是數據降維。在實驗中引用PCA，以此實現對1H NMR的數據分析，為設置實驗條件提供科學依據。為了保證PCA與數據要求相符合，我們首先要處理1H NMR譜。具體操作方法如下：首先對甲基質子峰積分面積進行設定，為1；然后利用專業的數據處理軟件，單位設置為20Hz，把1H NMR譜圖劃分為多個小區，每個小區均等，將各個小區相對積分面積值進行獲取，對殘留水峰區和殘留質子峰區數據進行刪除處理；再次對所得數據進行轉換為ASC II文件，將其輸出，通過EXCEL做歸一化處理，并對數據格式進行轉置。該步驟完成之后，輸至PCA專業軟件中進行分析，最終結果以“載荷圖”和“得分圖”體現出來。

2　結果分析

2.11H NMR譜圖

為了便于進行PCA分析，需要進行指認歸屬的位移區段，對不同條件下樣品的物質含量進行了考察，這樣做的目的在于能夠將最佳制備條件提取出來。首先有針對性地對T1提取物1H NMR譜指認，憑借核磁共振對部分信號進行了確證。

圖1　1H NMR譜圖

根據圖1特征，將其劃分為4個區段。通過對圖1進行觀察，我們能夠觀察到下列信息：I區只包含甲基質子信號，這樣在進行后續處理時，就有了保證。Ⅱ區信號強度相對適中，分布也比較均勻，信號之間出現分離，以便于指認。出現的信號主要是飽和烷基質子。茶葉中包含的大量糖苷、咖啡因和糖等質子信號都體現在Ⅲ區中，通過圖1我們可以看出，該區內的信號總體來說較強，具有嚴重的譜線重疊，該區中有很多信號不能直接指認。Ⅳ區信號非常分散，而且共振譜線之間的強度差異十分明顯。在接下來的實驗中發現，該區信號對茶葉品種極為敏感，容易識別的信號有氮雜環、芳香環、和烯烴等質子。

2.2優化提取條件

在設計預處理方法時，從四個方面進行了優化，分別是調整了溶劑的配比、樣本量比例、提取溫度和時間。具體步驟是將上述四個條件結合起來，分別獲取四種茶葉的1H NMR譜圖，依次進行預處理和PCA分析，得出分別對應的主成分得分圖以及載荷圖，共四組。在這里，由于篇幅限制不將圖進行一一列舉。通過得分圖能夠發現制備條件的變化對樣本點分布產生了哪些影響。其分布取決于PC1、PC2得分。而得分受到位移區段的影響。這樣一來，就能夠得知制備條件的不同會對哪些成為提取量產生影響。具體制備條件如下：

第一，溶劑配比。提取劑極性取決于溶劑配比，對提取到的物質提取量多少也有著直接關系，以指紋譜形式反映出來。等量稱取經研磨過篩處理的茶葉樣本共10份，分別加入1000 μL以氘代甲醇和提取劑，提取劑體積分數從10％以每次增加10％為準，直至100％為止。在超聲下進行30min提取，樣本量比例為12。通過前文所述方法得出10個樣品，對10樣品依次編號。在第一、二主成分空間上將樣品1H NMR譜圖進行投影。

第二，提取劑的用量。提取劑用量對提取效率有很大的影響。以70％ 的MeDo為提取劑用量，在40℃超聲條件下進行30min提取，然后進行篩選。對T1樣本進行平行稱取，共6份，每份重量控制在100mg。誤差不超過0.1mg。依次加入提取劑，提取劑量從600μL以每次200μL遞增，最高提取劑量為1600μL，共產生6個樣品，依次進行編號。

第三，提取溫度。溫度控制在整樣品的整個制備過程中非常重要。將經過研磨過篩處理的T1樣本進行平衡稱取，共6份，每份質量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。參照上一步驟加入提取劑，分別置于溫度20℃、3O℃、40℃、50℃、60℃和65℃下，進行30min的超聲提取。共產生6個樣品，依次進行編號。

第四，提取時間。經過研磨過篩處理的T1樣本進行平衡稱取，共5份，每份質量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。參照上一步驟加入提取劑，置于溫度為60℃的條件下進行下超聲提取，提取時間從10min以每次10min遞增，最長時間為50min，共產生5個樣品，依次進行編號。

根據實驗結果，得出以下分析：在上述4個條件中，樣品最大的制備條件是提取劑的配比；然后是提取劑量。關于提取溫度和時間，應當根據實際情況進行合理選擇。通過對上述4個制備條件的綜合分析，最終決定本次實驗制備條件：提取劑是70％MeOD，提取劑用量是12，提取溫度和時間分別是60℃、20min。

2.3分析樣品

以前文所述4種茶葉作為樣本，憑借指紋測試考察了的預處理方案的可行性。經過研磨過篩處理的4個樣本進行平衡稱取，共3份，每份質量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。樣品數量為12，分別進行標記。每一個樣品都要進行3次平行測量，一共得到了36張1H NMR譜圖，經過轉化之后，一共獲取了36組樣本。對全部樣品進行PCA分析，并得到了投影判別圖。發現4組樣本數據點之間的離散非常明顯，而且每一類樣本都出現了聚類現象。

表1　4種茶葉樣品離散因子表

由于上述測試所得到的效果非常好，因此，對預處理效果考察借助離散因子就可以體現出來。通過表1我們可以直觀看出，除了T4樣本以外，離散因子均不超過10，該樣本雖然離散因子較大，但是也控制在了90左右。除此之外，根據表1能得出下列結論：（1）單一樣本的聚集度較高，預處理方法的穩定性非常高，同時，具有良好的重現性；（2）兩個樣本的數據點之間呈現高度離散現象，即使T1和T2兩個樣本屬于一種性質，與單一樣本相比，離散分子的倍數超過33倍。由此可見，原始數據中含有能對樣品差異進行充分反映的特征信息。

根據實驗結果，得出本次預處理方法非常可靠的結論。在本次預處理方法下可能產生的偏差要遠遠小于樣品自身內源差異。因此符合指紋技術要求。

3　結　語

本文以超聲提取作為提取方法，這一方法在實驗室研究中十分普遍。該方法不僅簡單、便于操作，而且具有極高的推廣價值，因此，對于普及指紋技術及其數據也是十分有利的。除此之外，在提取劑方面進行替換，本文所采用的提取劑不僅操作起來更為簡單，而且對實驗過程中由于轉移導致的樣品算是和污染做到了保證，同時對實驗重現性也做到了有效保證。

參考文獻

[1]趙蕊.歐陽捷.杜樹山.耿珠峰.許美鳳.鄧志威.茶葉化學成分指紋識別中樣品制備方法的優化[J].高等學校化學學報，2010（1）.

[2]馬媛媛.在茶葉成分中提取咖啡因的試驗方法及改進[J].科技展望，2015（25）.