激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟活疫苗工藝的研究

鄭朝朝 柳珊 鄒立宏 劉云濤 劉濤 郁宏偉

摘要：為建立規(guī)模化培養(yǎng)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝，本研究利用工作體積為10L的激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞（swine testis，ST），接種豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）進(jìn)行培養(yǎng)研究。研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)4d細(xì)胞數(shù)可增長(zhǎng)5-7倍，接種病毒后15d可收獲毒液6次，收獲量至少與200個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶單次收獲量相當(dāng)，產(chǎn)品各項(xiàng)檢測(cè)均合格。本工藝極大地縮短了培養(yǎng)時(shí)間，為規(guī)模化培養(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

關(guān)鍵詞：豬瘟；脾毒；細(xì)胞毒；激流灌注式生物反應(yīng)器

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種熱性、急性、接觸性傳染病。此病于1833年首先在美國(guó)等地發(fā)現(xiàn)，以后遍及世界各大洲，發(fā)病率和死亡率高，危害極大。豬瘟的治療無(wú)特效藥物，最有效的方法就是疫苗的免疫接種，因此疫苗免疫效果的優(yōu)劣對(duì)豬瘟防控起了決定性作用。2007年9月，豬瘟兔化弱毒脾淋疫苗被農(nóng)業(yè)部定為政府采購(gòu)?fù)茝V應(yīng)用的首選疫苗。

本研究中應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器（工作體積為10L）對(duì)豬瘟病毒的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了初步探索：以第一代細(xì)胞毒做為毒種，培養(yǎng)15d可收獲毒液6次，各收次病毒液效價(jià)均可達(dá)到1.0×lO⁶RID/mL以上，病毒收獲量至少與200個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng)，且各種檢測(cè)均符合規(guī)程要求。該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，培養(yǎng)時(shí)間縮短一半，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，效價(jià)高。該工藝的建立為規(guī)模化培養(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豬睪丸細(xì)胞（ST）購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒（CSFV）由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司種毒室提供；安全檢驗(yàn)用豬瘟抗體陰性豬購(gòu)自河北唐縣某豬場(chǎng)；效力檢驗(yàn)用家兔購(gòu)自河北定州某兔場(chǎng)。

1.2 主要試劑、設(shè)備

高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GJIBCO公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；豬瘟專(zhuān)用新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司；豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自愛(ài)德士元亨試劑公司。AP20C型激流灌注式多功能生物反應(yīng)系統(tǒng)購(gòu)自杭州安普生物工程有限公司（工作容積10L）。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

以常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代增殖ST細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞的單日葡萄糖消耗量。

1.4 毒種的制備

取已形成良好單層的ST細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，接種豬瘟脾毒毒種，取二收、三收的毒液做為生產(chǎn)用細(xì)胞毒毒種，備用。

1.5 細(xì)胞罐體接種與培養(yǎng)

以常規(guī)方法消化已長(zhǎng)成良好單層的轉(zhuǎn)瓶ST細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器灌注袋內(nèi)，接種密度為1.0-2.0×10⁷cells/g。靜置吸附1h。吸附過(guò)程完成后向反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)加入含8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。設(shè)定設(shè)備參數(shù)：T1：37℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.3 ，D0：50%-70%，振蕩速度20r/min，空氣流量100mL/min，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

每12h取樣一次，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)液葡萄糖濃度。當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)液或者換液，維持殘?zhí)菨舛龋⒏鶕?jù)葡萄糖消耗量，分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.6 病毒接種、培養(yǎng)與收獲

細(xì)胞培養(yǎng)至第4d葡萄糖消耗量趨于平穩(wěn)時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM液沖洗灌注袋，接種CSFV細(xì)胞毒毒種800mL，設(shè)定設(shè)備參數(shù)，T1：36.5℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.4，D0：50%-70%啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序，進(jìn)行病毒培養(yǎng)。

自接毒后每8h取樣測(cè)糖、測(cè)效價(jià)，接毒24h補(bǔ)充2倍濃縮DMEM液；前3收每48h進(jìn)行一次收獲換液；4-6收每72h進(jìn)行一次，每次換液后48h補(bǔ)充200g/L的葡萄糖，使殘?zhí)菨舛染S持在1.5g/L。

1.7、半成品檢驗(yàn)

無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行。

半成品病毒含量測(cè)定用豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)兩種方法測(cè)定。

1.8 疫苗的制備與檢驗(yàn)

1.8.1 疫苗制備

將檢驗(yàn)合格的病毒液混合于同一容器，加入牛奶蔗糖凍干保護(hù)劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。

1.8.2 疫苗安全性檢驗(yàn)

按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份，肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭，每頭5mL，觀察2ld。

1.8.3 疫苗效力檢驗(yàn)

疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL，耳靜脈注射家兔2只，1.0mL/只，觀察96h。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好（如圖1）。

2.2 細(xì)胞罐體接種與培養(yǎng)

接種至激流灌注式生物反應(yīng)器灌注袋的細(xì)胞總數(shù)約2.5×10⁹個(gè)。細(xì)胞接種至反應(yīng)器后，每12h葡萄糖消耗量呈逐步增長(zhǎng)的趨勢(shì)（如圖2），從0.11g/L直至0.90g/L。

2.3 病毒接種、培養(yǎng)、收獲與檢驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)至第4d（72-96h）葡萄糖消耗量趨于平穩(wěn)，約17g/24h，接種豬瘟病毒。

接毒24h補(bǔ)充2倍濃縮DMEM液；前3收每48h進(jìn)行一次收獲換液；4-6收每72h進(jìn)行一次，每次換液后48h補(bǔ)充200g/L的葡萄糖，使殘?zhí)菨舛染S持在1.5g/L。

收獲1-6收各收次毒液，檢測(cè)效價(jià)，6個(gè)收次的病毒液效力均在1.0×10⁶RID/mL以上（如表1）。

6個(gè)收次的病毒液按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010年版）附錄進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)，兀細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)和外源病毒污染；病毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用。

2.4 疫苗成品的安全和效力檢驗(yàn)

接種疫苗后觀察2ld，所有試驗(yàn)豬體溫、精神、食欲兀明顯變化，無(wú)異常臨床反應(yīng)，疫苗安全檢驗(yàn)合格。

家兔接種疫苗后觀察4d，2只家兔一只為定型熱（++），另一只為輕熱（+），疫苗效力檢驗(yàn)合格。

3 討論

通過(guò)本研究成功建立了應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝，應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟病毒能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度生長(zhǎng)，而且自動(dòng)化水平較高，生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定可控，降低了產(chǎn)品批間差異，有利于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究中應(yīng)用工作體積為10L激流灌注式生物反應(yīng)器對(duì)豬瘟病毒的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了探索，新建立的豬瘟病毒生產(chǎn)工藝一個(gè)周期病毒收獲量至少與200個(gè)轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng)，該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，培養(yǎng)時(shí)間縮短一半，大大提高了生產(chǎn)效率，對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本有明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究中采用試劑盒和兔體熱反應(yīng)兩種方法對(duì)半成品毒液進(jìn)行了抗原含量檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系，因此，應(yīng)用豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原含量有一定的可行性，但是應(yīng)當(dāng)注意到豬瘟抗原試劑盒檢測(cè)的是豬瘟病毒的E2蛋白，而不是整個(gè)病毒，但是存在假陽(yáng)性。（編輯：趙曉松）