激流灌注式生物反應器培養豬瘟活疫苗工藝的研究

鄭朝朝 柳珊 鄒立宏 劉云濤 劉濤 郁宏偉

摘要：為建立規模化培養豬瘟活疫苗的生產工藝，本研究利用工作體積為10L的激流灌注式生物反應器培養豬睪丸細胞（swine testis，ST），接種豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）進行培養研究。研究結果顯示，培養4d細胞數可增長5-7倍，接種病毒后15d可收獲毒液6次，收獲量至少與200個10L轉瓶單次收獲量相當，產品各項檢測均合格。本工藝極大地縮短了培養時間，為規模化培養工藝的推廣與使用提供了技術參數。

關鍵詞：豬瘟；脾毒；細胞毒；激流灌注式生物反應器

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種熱性、急性、接觸性傳染病。此病于1833年首先在美國等地發現，以后遍及世界各大洲，發病率和死亡率高，危害極大。豬瘟的治療無特效藥物，最有效的方法就是疫苗的免疫接種，因此疫苗免疫效果的優劣對豬瘟防控起了決定性作用。2007年9月，豬瘟兔化弱毒脾淋疫苗被農業部定為政府采購推廣應用的首選疫苗。

本研究中應用激流灌注式生物反應器（工作體積為10L）對豬瘟病毒的培養工藝進行了初步探索：以第一代細胞毒做為毒種，培養15d可收獲毒液6次，各收次病毒液效價均可達到1.0×lO⁶RID/mL以上，病毒收獲量至少與200個10L轉瓶的單次收獲量相當，且各種檢測均符合規程要求。該工藝與原有的轉瓶生產工藝相比，培養時間縮短一半，產品質量穩定，效價高。該工藝的建立為規模化培養工藝的推廣與使用提供了技術參數。

1 材料和方法

1.1 細胞、病毒及實驗動物

豬睪丸細胞（ST）購自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒（CSFV）由瑞普（保定）生物藥業有限公司種毒室提供；安全檢驗用豬瘟抗體陰性豬購自河北唐縣某豬場；效力檢驗用家兔購自河北定州某兔場。

1.2 主要試劑、設備

高糖DMEM培養基購自GJIBCO公司；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司；豬瘟專用新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶購自GIBCO公司；豬瘟抗原檢測試劑盒購自愛德士元亨試劑公司。AP20C型激流灌注式多功能生物反應系統購自杭州安普生物工程有限公司（工作容積10L）。

1.3 細胞復蘇與培養

以常規方法復蘇、傳代增殖ST細胞，并檢測細胞的單日葡萄糖消耗量。

1.4 毒種的制備

取已形成良好單層的ST細胞，棄去培養液，接種豬瘟脾毒毒種，取二收、三收的毒液做為生產用細胞毒毒種，備用。

1.5 細胞罐體接種與培養

以常規方法消化已長成良好單層的轉瓶ST細胞，收集細胞懸液并計數，將細胞接種至生物反應器灌注袋內，接種密度為1.0-2.0×10⁷cells/g。靜置吸附1h。吸附過程完成后向反應器系統內加入含8%新生牛血清的DMEM培養基。設定設備參數：T1：37℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.3 ，D0：50%-70%，振蕩速度20r/min，空氣流量100mL/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養。

每12h取樣一次，用葡萄糖檢測試劑盒檢測營養液葡萄糖濃度。當殘糖濃度低于1g/L時，開始補液或者換液，維持殘糖濃度，并根據葡萄糖消耗量，分析細胞生長情況。

1.6 病毒接種、培養與收獲

細胞培養至第4d葡萄糖消耗量趨于平穩時，棄去培養液，用不含血清的DMEM液沖洗灌注袋，接種CSFV細胞毒毒種800mL，設定設備參數，T1：36.5℃、T2：40℃、T3：36℃，pH：7.4，D0：50%-70%啟動病毒培養程序，進行病毒培養。

自接毒后每8h取樣測糖、測效價，接毒24h補充2倍濃縮DMEM液；前3收每48h進行一次收獲換液；4-6收每72h進行一次，每次換液后48h補充200g/L的葡萄糖，使殘糖濃度維持在1.5g/L。

1.7、半成品檢驗

無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行。

半成品病毒含量測定用豬瘟抗原檢測試劑盒和兔體定型熱反應兩種方法測定。

1.8 疫苗的制備與檢驗

1.8.1 疫苗制備

將檢驗合格的病毒液混合于同一容器，加入牛奶蔗糖凍干保護劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。

1.8.2 疫苗安全性檢驗

按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份，肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭，每頭5mL，觀察2ld。

1.8.3 疫苗效力檢驗

疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL，耳靜脈注射家兔2只，1.0mL/只，觀察96h。

2 結果

2.1 細胞復蘇與培養

細胞復蘇后，傳代培養，細胞生長狀態良好（如圖1）。

2.2 細胞罐體接種與培養

接種至激流灌注式生物反應器灌注袋的細胞總數約2.5×10⁹個。細胞接種至反應器后，每12h葡萄糖消耗量呈逐步增長的趨勢（如圖2），從0.11g/L直至0.90g/L。

2.3 病毒接種、培養、收獲與檢驗

細胞培養至第4d（72-96h）葡萄糖消耗量趨于平穩，約17g/24h，接種豬瘟病毒。

接毒24h補充2倍濃縮DMEM液；前3收每48h進行一次收獲換液；4-6收每72h進行一次，每次換液后48h補充200g/L的葡萄糖，使殘糖濃度維持在1.5g/L。

收獲1-6收各收次毒液，檢測效價，6個收次的病毒液效力均在1.0×10⁶RID/mL以上（如表1）。

6個收次的病毒液按照《中華人民共和國獸藥典》（2010年版）附錄進行純凈性檢驗，兀細菌、霉菌、支原體生長和外源病毒污染；病毒液對豬安全無副作用。

2.4 疫苗成品的安全和效力檢驗

接種疫苗后觀察2ld，所有試驗豬體溫、精神、食欲兀明顯變化，無異常臨床反應，疫苗安全檢驗合格。

家兔接種疫苗后觀察4d，2只家兔一只為定型熱（++），另一只為輕熱（+），疫苗效力檢驗合格。

3 討論

通過本研究成功建立了應用激流灌注式生物反應器生產豬瘟活疫苗的生產工藝，應用激流灌注式生物反應器培養ST細胞生產豬瘟病毒能實現細胞高密度生長，而且自動化水平較高，生產過程穩定可控，降低了產品批間差異，有利于穩定產品質量。

本研究中應用工作體積為10L激流灌注式生物反應器對豬瘟病毒的培養工藝進行了探索，新建立的豬瘟病毒生產工藝一個周期病毒收獲量至少與200個轉瓶的單次收獲量相當，該工藝與原有的轉瓶生產工藝相比，培養時間縮短一半，大大提高了生產效率，對于穩定產品質量，降低生產成本有明顯優勢。

本研究中采用試劑盒和兔體熱反應兩種方法對半成品毒液進行了抗原含量檢測，根據檢測結果可以看出兩者之間呈正相關關系，因此，應用豬瘟抗原檢測試劑盒檢測抗原含量有一定的可行性，但是應當注意到豬瘟抗原試劑盒檢測的是豬瘟病毒的E2蛋白，而不是整個病毒，但是存在假陽性。（編輯：趙曉松）