HO-1蛋白介導艾灸預處理改善大鼠腦缺血再灌注損傷機制的初步研究

李秀坤，劉旭光，楊慎峭

(1.四川中醫藥高等專科學校，四川 綿陽 621000;2.成都中醫藥大學，成都 610075)

HO-1蛋白介導艾灸預處理改善大鼠腦缺血再灌注損傷機制的初步研究

李秀坤1，劉旭光2，楊慎峭2

(1.四川中醫藥高等專科學校，四川 綿陽 621000;2.成都中醫藥大學，成都 610075)

目的:觀察艾灸預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及部分機制研究。方法:將實驗按隨機數字表法分為假手術組、腦缺血再灌注損傷組(MCAO組)、艾灸預處理每日1次組、艾灸預處理每日2次組4組，TTC染色及圖像軟件分析大鼠腦梗死體積，western-blot法檢測腦組織中血紅素氧合酶-1(HO-1)表達的變化。結果:MCAO組出現明顯的神經功能缺失，各預處理組癥狀明顯改善，且預處理組每日2次組優于每日1次組;假手術組腦組織均勻紅色無梗死灶，MCAO組明顯梗死蒼白區;艾灸預處理較MCAO梗死體積均減小，且預處理每日2次組最為明顯;MCAO組血漿CO濃度顯著升高，各預處理組CO濃度降低，且每日2次組最顯著;MCAO組HO-1蛋白表達均顯著增加，各預處理組HO-1蛋白表達顯著降低。結論:艾灸預處理能保護腦組織缺血再灌注損傷，其機制可能與通過下調HO-1蛋白表達，減少CO的合成和釋放有關。

艾灸預處理;腦缺血再灌注;保護機制;CO;HO-1蛋白

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦缺血一定時間再恢復血液供應后，大腦功能不僅沒有得到及時恢復，反而出現更加嚴重的功能活動障礙［1］。Kitagawa等研究發現到缺血預處理 (ischemic preconditioning，IPC)對沙土鼠腦缺血具有保護作用［2］。近年來的實驗發現，除缺血外其他多種預處理方式主要有缺氧、藥物、高溫、針刺預處理等。艾灸預處理(ischemic preconditioning，IP)能夠誘導缺血耐受效應(ischemic tolerance，IT)，即一次或多次短暫缺血可以作為一種損傷性應激原，有效調動機體的內源性保護機制，產生保護作用［3］。HO-1為誘導性蛋白，正常生理情況下機體組織內的表達量很少，但在一些應激因素作用下可被大量誘導，如缺血、缺氧和炎癥等［4］。本文擬通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，研究腦組織中細胞凋亡的過程，艾灸預處理對其的保護作用及腦組織中HO-1蛋白表達的變化，為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供科學依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級 SD種大鼠8周齡，體質量180～220 g，雌雄不拘，室溫下自由飲水飲食，實驗開始前12 h禁食禁水。大鼠由成都中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(川)2011-11)。

1.2 試劑

HO-1單克隆抗體(北京中杉);二抗為HRP標記兔多克隆(美國SANTA CRUZ);氯化-2，3，5-三苯基四氮唑，TTC(天津福晨);β-actin(博奧森);二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒，其余均為國產分析純。

1.3 儀器

圖像采集軟件(德國 Lecia);數據分析系統(上海山富科學儀器有限公司);Biosens Digital Imaging System v1.6;電熱恒溫干燥箱(DHG-9031，上海);1/萬電子天平(BS224S，德國);病理切片機(HM2235，德國);AUTO-CAD圖像處理軟件等;垂直電泳儀及轉膜儀(北京六一)。線栓制備:魚線直徑 0.22 mm、長35 mm，完全浸泡在水合氯醛溶液中，消毒和軟化魚線，取出后脫脂棉擦拭1次、純水沖洗2次自然風干。造模時浸泡在生理鹽水中備用［5］。

1.4 方法

1.4.1 大鼠腦缺血模型制備 利用改良線栓法制備SD大鼠全腦缺血模型［5］，在室溫下，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于蠟板上剪毛、消毒，頸部正中部位縱行切開皮膚約2 cm長，鈍性分離皮下組織，沿血管方向縱行鈍性分離頸總動脈和頸外動脈;頸總動脈處置一根手術線不結扎，頸外動脈處置兩根手術線，距分叉4 mm處結扎第1根手術線，在線結的遠心端2 mm處結扎第2根手術線，于兩線結之間高頻電刀電凝夾閉血管，眼科剪剪斷血管;分離頸外動脈第一分支枕動脈并電凝灼斷血管，接著分離頸內動脈，微動脈夾夾閉頸內動脈和頸總動脈;于頸外動脈起始處置一手術線，打單結不收緊，緊靠殘端線結處眼科剪垂直血管剪口;取出泡在生理鹽水中的魚線，從剪口處插進魚線達頸內動脈夾閉處，松開頸內動脈的動脈夾，緩慢推進魚線遇阻力時停止，結扎頸外動脈起始處的手術線，松開夾閉頸總動脈的動脈夾。記錄缺血開始的時間，缺血90 min后緩慢拔出魚線［6］，記錄再灌注開始的時間。假手術組只分離頸總、頸外和頸內動脈，不插栓線［7］。

1.4.2 取穴與方法 根據《世界衛生組織標準針灸經穴定位(西太平洋地區)》［8］中的取穴方法，選擇“百會”(頂骨正中)、“大椎”(第7頸椎與第1胸椎間，背部正中)、“足三里”(后三里，膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處)。艾灸方法:將艾條自制成直徑約4 mm的細艾條，距穴位約2 cm左右懸起施灸，以動物安定為度，每穴灸15 min，每天1次，共灸7 d。

1.4.3 實驗分組 將實驗按隨機數字表法分為假手術組、MCAO組、艾灸預處理每日1次組、艾灸預處理每日2次組4組各24只。假手術組僅暴露頸總、頸外和頸內動脈，不插栓線;MCAO組按1.4方法中行MCAO手術，2 h后行再灌注;艾灸預處理每日 1次組艾灸施灸 7 d后，對大鼠進形MCAO手術，2 h后行再灌注;艾灸預處理每日2次組每日2次艾灸，其余操作同艾灸預處理每日1次組。各組大鼠再灌注后24 h觀察神經行為學評分。

1.4.4 神經行為學評分 依照 Longa等6分制神經學評分原則對大鼠行為進行評分。評分原則(大鼠清醒后1 h):0分:正常，無神經系統異常的體征;1分:不能完全伸展病變對側前爪;2分:行走時向對側旋轉;3分:行走時向對側傾倒;4分:不能自發行走，喪失意識;5分:意外死亡、再灌注24 h內死亡、蛛網膜下腔出血的大鼠被剔除［9］。1～4分者為成功模型。

1.4.5 TTC染色法檢測腦梗死體積 大鼠缺血再灌注24 h后，每組隨機選取存活的5只SD大鼠斷頭取腦，除去小腦和低位腦干、嗅球。將腦沿冠狀面切成2 mm厚度，腦片置于質量分數為 l%的TTC溶液10 mL中，37℃避光孵育30 min。正常組織呈紅色，梗死組織呈白色，數碼相機正反面拍照，利用Image-pro 6.0分析腦片的梗死面積占腦片總面積的百分比［10］。

目前，昆明市全市總人口672.8萬人，其中少數民族人口127.36萬人，占全市總人口的18.9%，少數民族流動人口40萬，占全市總人口的5.9%。呈現成份多、分布廣、居住散，大多以經商、打工、招聘、婚姻等流動方式出現，他們大多不在城市長期居住，呈現出無定所、居住分散、流動性大、無組織、結構復雜等特點。

1.4.6 血漿 CO含量測定 聯二亞硫酸鹽還原法檢測血漿中CO的濃度，將以上4組大鼠再灌注24 h以微吸管收集股靜脈血10 μL，即刻放于已裝滿液體的試管內用封口膜封好，備測 CO濃度［11］。分別波長541 nm、555 nm處測吸光度，計算兩者的比值，根據標準曲線計算出CO的量。

1.4.7 免疫印跡檢測 HO-1蛋白的表達 取100 mg腦組織加入500 uL裂解液，4℃持續振搖30 min，離心5000 r/min×10 min后，吸取上清轉入預冷的離心管，考馬斯亮蘭試劑測定組織中的蛋白濃度，樣品加以上樣緩沖液稀釋后煮沸5 min使蛋白變性備用。灌制SDS-PAGE凝膠，取已制備好的組織蛋白，根據蛋白濃度檢測結果計算每孔上樣量后進行上樣，在80 V電泳約90 min至溴酚藍指示劑觸凝膠底部，電泳后用100 mA電流將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜，濾膜經5%脫脂奶粉封閉過夜、剪膜，根據分子量分開后分別加入1∶500稀釋的HO-1及內參抗體(β-actin 1∶3000)室溫孵育3～4 h，TBST洗膜3次，以1∶2000稀釋的HRP標記二抗孵育1 h后，再次洗膜3次，ECL發光液發光后X光片曝光，掃描記錄結果，Gel-analyze分析軟件分析條帶灰度，進行半定量比較分析，根據灰度比值計算蛋白的表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 腦梗死體積以及神經行為學評分

表1顯示，假手術組表現無神經功能缺失，MCAO組及各治療組均出現明顯神經功能缺失，且各艾灸預處理組與MCAO組比較，神經行為學評分差異顯著(P＜0.05);艾灸預處理每日1次組與艾灸預處理每日2次組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1圖1顯示，假手術組腦組織呈均勻紅色無梗死灶，MCAO組和各艾灸預處理組可見梗死蒼白區。與假手術組比較，MCAO組及艾灸預處理每日1次組、每日2次組均有明顯的白色梗死灶，差異有統計學意義(P＜0.05);與 MCAO組比較，艾灸預處理每日1次組、艾灸預處理每日2次組梗死體積均減小，艾灸預處理每日2次組最為明顯。

表1血漿中CO的濃度檢測結果顯示，大鼠腦缺血再灌注可使血漿CO濃度升高，與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，艾灸預處理每日1次組、每日2次組可使 CO濃度降低，且每日行灸2次血漿中 CO的濃度降低幅度最大(P＜0.01)。

表1 各組腦梗死體積、神經行為學以及血漿CO的變化(±s)

表1 各組腦梗死體積、神經行為學以及血漿CO的變化(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與 MCAO組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 例數 Neurological scores Infarct volume(%) CO (μmol/L) 5 0 0 12.54±2.50 MCAO 組 5 3.4±1.03 33.52±3.73 20.33±4.16＊＊艾灸預處理每日1次組 5 2.3±0.86 24.14±4.38 17.26±3.24△艾灸預處理每日2次組 5 1.2±0.65 20.34±3.07 15.41±3.05假手術組△△

圖1 TTC檢測大鼠腦梗死體積

2.2 HO-1蛋白的表達

表2圖2顯示，與假手術組比較，MCAO組HO-1蛋白表達均顯著增加(P＜0.01);與 MCAO組比較，艾灸預處理每日1次組、艾灸預處理每日2次組HO-1蛋白表達顯著降低 (P＜0.05);與艾灸預處理每日1次組比較，艾灸預處理每日2次組 HO-1蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。

表2 各組HO-1蛋白的表達

圖2 HO-1蛋白的表達

3 討論

腦缺血是指腦血流量的減少或血流中斷，再灌注是指腦缺血后血流減少區域的血流增加或產生血流的復通，同時會在某些情況下(如炎癥反應)加重已缺血細胞、組織的進一步損傷［2］。近年來，對缺血性腦損害提出了預防性腦保護的概念，即預防性使用某些藥物或措施后，能減輕缺血性腦損害的程度，改善預后，起到腦保護作用［12］。

隨著人們預防觀念的逐漸加強，未病先防成為人們研究的熱點［13］。“治未病”一詞最早來源于《黃帝內經》，是中醫學里重要的防治思想。中醫治未病的方法眾多，或藥、或針、或灸、或傳統健身運動，因艾灸本身具有溫熱散寒、助元固本的功效，且操作簡單、取材方便、價格相對低廉，因此艾灸常常被作為治未病的最佳方法，被臨床廣泛應用［14］。艾灸預處理即“逆灸”，屬于逆針灸的一部分，即在機體健康無病、疾病發生之前或疾病發展輕淺之時，預先應用艾灸方法，激發經絡之氣，增強機體的抗病與應變能力，促進健康、保健延年、防止疾病的發生或疾病損害的傳統方法，是針灸“治未病”的重要內容［15］。逆灸通過在疾病未顯露之時或發病之初，運用針灸之法增強機體的抵抗力，迅速截斷疾病的發展及傳變，以達到預防疾病的目的，這種思想和現代醫學所提出的“預處理”本質基本相同，就是通過預防性措施，最終將機體的損害降至最低，故逆灸是“治未病”的重要手段［13］。

本研究中，大鼠經MCAO造模后出現明顯的神經功能缺失癥狀，艾灸預處理則能顯著改善該癥狀，且預處理每日2次組較每日1次組缺失癥狀改善明顯，充分說明艾灸預處理每日2次組能顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的神經功能缺失癥狀。進一步觀察腦梗死體積研究發現，MCAO組可見大面積梗死蒼白區，說明實驗造模成功。艾灸預處理組的白色梗死灶體積顯著減小，尤以預處理每日2次組最明顯。由此可見，使用艾灸預處理不僅能改善腦缺血再灌注損傷造成的神經功能缺失癥狀，還能減少腦梗死灶體積，發揮保護作用，且每日行灸2次為最佳。

一氧化碳(carbon monoxide，CO)是重要的血管舒張因子和氣體信使分子，具有促進損傷細胞的恢復、并能松弛血管平滑肌、阻止血小板聚集的作用，其在生物體內的作用方式與一氧化氮比較相似。研究表明，內源性的CO通過激活cGMP而起到腦保護作用［11］。血色素氧合酶(Heme oxygenase，HO)是合成CO的關鍵酶［16］，有三類形式同工酶即HO-1、HO-2、HO-3，其中以HO-1在體內的分布最為廣泛。HO-1是目前已知最易受誘導的酶，能夠接受各種應激刺激誘導其表達增強，如缺氧、ROS、細胞因子、NO、重金屬離子等，HO-1/CO的表達調控作為一種防御機制在對抗氧化應激、炎癥、缺血再灌注中均有重要作用［17］。本研究中，大鼠腦缺血再灌注血漿CO濃度升高，艾灸預處理可使CO濃度降低。MCAO組隨著損傷程度加深，HO-1的蛋白表達量越高;艾灸預處理HO-1蛋白表達顯著降低，每日2次組較每日1次顯著降低，繼而降低了CO的合成和釋放，發揮腦保護作用，從而減輕腦缺血再灌注所造成的神經功能損傷，且艾灸預處理每日2次的保護作用最佳。由此可見，抑制HO-1的表達，減少CO的合成是艾灸預處理對大鼠腦缺血再灌注后腦保護作用機制之一。

未病先防，已病及時處理，防微杜漸，疾病初愈后將息調養，防其復發，經過歷代醫家的不斷充實發展，逐步形成了內涵豐富、特色鮮明的“治未病”體系。本實驗僅研究了腦組織中HO-1蛋白的表達對艾灸預處理大腦缺血再灌注損傷保護作用的機制研究，艾灸預處理如何實現其抗凋亡，值得進一步深入研究。

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Preliminary Study on Improving the Mechanism of Cerebral Ischemia Reperfusion Injury In Rats By Ho-1 Protein Mediated Moxibustion Preconditioning

LI Xiu-kun1，LIU Xu-guang2，YANG Shen-qiao2
(1.Sichuan College of Traditonal Chinese Medicine，Sichuan Mianyang 621000，China; 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 610075，China)

Objective:To observe the effects of moxibustion preconditioning on the protection effects and mechanisms on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.Methods:The experiment was divided into control group，sham operation group，ischemia reperfusion injury group(MCAO group)，Moxibustion preconditioning group 1 /d and moxibustion pretreatment of 2/d group，the infarct volume of rats in each group were analyzed by TTC staining and image software，and using Western-blot method to detect the changes of heme oxygenase the enzyme-1(HO-1)expression in brain tissues.Results:MCAO group showed significant loss of nerve function，The symptoms of each pretreatment group were significantly improved，And pretreatment of the 2/d group is better than the 1/d group;The brain tissue of sham operation group was evenly and without infarction，MCAO group was significantly infarct pale area;Moxibustion pretreatment decreased the infarct volume of MCAO，And pretreatment of the 2/d group is the most obvious;The plasma CO concentration of MCAO group was significantly increased，Reduction of CO concentration in each pretreatment group，And the 2/d group is the most obvious;The expression of HO-1 protein in MCAO group were significantly increased，The expression of HO-1 protein was significantly lower in each pretreatment group.Conclusion:Moxibustion preconditioning can protect cerebral ischemia reperfusion injury，The mechanism may be related to the down-regulation of HO-1 protein expression and reducing the synthesis and release of CO.

Moxibustion preconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Protection mechanism;HO-1 protein

R245.81

:B

:1006-3250(2016)07-0918-04

2016-01-15

李秀坤(1976-)，女，河北保定人，講師，醫學碩士，從事神經系統疾病針灸康復的臨床與研究。