針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

任　茜 綜述，何成松 審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科，四川瀘州 646000)

?

針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

任茜 綜述，何成松△審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科，四川瀘州 646000)

[關(guān)鍵詞]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；Th17細胞；IL-17；生物制劑

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一個慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)炎癥和滑膜增生為主要特點，常導(dǎo)致骨及軟骨的破壞，有較高的致殘率，嚴(yán)重影響功能活動及生活質(zhì)量[1]。其發(fā)病機制尚不明確，目前研究認為輔助性T細胞17(T help cell 17,Th17)及產(chǎn)生的白細胞介素-17(IL-17)在RA發(fā)病機制中有關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)的改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARDS)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)拮抗劑能有效的治療RA，但仍有許多患者對其不耐受或反應(yīng)不佳。而針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑為RA的治療提供了新的方向。

1Th17細胞

Th17細胞是一類重要的介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細胞，在自身免疫性疾病及機體防御反應(yīng)中起著重要作用。并且，它主要分泌IL-17、IL-6、IL-21、IL-22等細胞因子，已有許多的研究證明Th17細胞在RA慢性炎癥及隨后的關(guān)節(jié)損傷中有至關(guān)重要的作用[2]。原始CD4+T細胞可分化成Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)等不同細胞亞群，這受特定細胞因子環(huán)境的影響。Annunziato等[3]認為，人類Th17細胞的分化可能是在炎性細胞因子如：IL-6、IL-21、IL-23存在的情況下，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)激活轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體(RORC)，誘導(dǎo)分化形成。IL-1β及IL-6促進Th17的擴增；IL-23促進其進一步增殖及穩(wěn)定。Th17細胞的分化受眾多細胞因子網(wǎng)絡(luò)及炎癥環(huán)境的影響。研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌群可通過特定的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)提供一個初始的促炎信號來啟動細胞因子的產(chǎn)生和Th17細胞的分化[4]。一種新型的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員——腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(tumornecrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)，可能通過結(jié)合Fn-14信號通路誘導(dǎo)Th17細胞分化及IL-17的表達，驅(qū)動炎性反應(yīng)的擴大[5]。最近，TL1A(TNF-like cytokine,TNFSF15)也被確認為TNF家族成員，它能促進TGF-β和IL-6誘導(dǎo)Th17細胞的分化，促進RORC mRNA的表達，增加RA患者血清IL-17A水平[6]。

2Th17/Treg平衡與RA

原始CD4+T細胞在RA發(fā)病機制中占中心地位，過去認為Th1/Th2細胞失衡是RA主要發(fā)病機制。根據(jù)目前假說[7]，Th1/Th2平衡及Th17/Treg平衡共同參與RA發(fā)病，而后者有更為重要的作用。所以，通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，可達到免疫調(diào)節(jié)作用。而RA患者血清中高水平的IL-17使研究人員更為關(guān)注細胞因子對Th17/Treg平衡的影響[8]。

3IL-17與RA

IL-17家族有6個成員(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F)，目前研究較多的是IL-17A，其余的研究尚少。IL-17是Th17細胞分泌的特征性細胞因子，參與宿主防御反應(yīng)，并且在RA發(fā)病機制中扮演重要角色[9]。IL-17高表達于RA患者滑膜液及血清，且與疾病活動性及嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。在RA發(fā)病早期，IL-17刺激成纖維滑膜細胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進血管生成[10]。并且，通過介導(dǎo)磷酸肌醇3激酶(PI3K)信號通路激活，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移和血管形成[11]。IL-17能驅(qū)動單核細胞的募集，促進TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞因子及趨化因子CCL2和CCL20的表達，促進關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)[12]。更重要的是，在IL-17的作用下，滑膜細胞及軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的過度表達，導(dǎo)致軟骨降解，進而出現(xiàn)軟骨損傷。而IL-17也可通過刺激核因子-κB(NF-κB)受體激動劑(RANKL)的表達，破壞RANKL/骨保護素平衡，刺激破骨細胞生成和骨侵蝕[13]。然而，IL-17不是孤立的一個細胞因子，它能與其他細胞因子形成錯綜復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)參與RA的發(fā)病。如：IL-17A協(xié)同TNF-α通過上調(diào)S100A8、MMPs、IL-1β的表達，明顯增強關(guān)節(jié)炎癥和損傷，造成不可逆的軟骨損害[14]。

4針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑在RA治療中的臨床研究

在RA的治療上，DMARDS使許多患者受益。然而，隨著對RA發(fā)病的細胞和分子機制研究的深入，出現(xiàn)了一類新型治療方法——生物制劑，當(dāng)前生物治療的主流是TNF-α拮抗劑。盡管這大大改善了許多RA患者預(yù)后，但仍有許多患者對其不耐受或治療效果欠佳。研究表明[15]，對TNF-α拮抗劑無應(yīng)答的RA患者Th17細胞數(shù)量明顯高于對TNF-α拮抗劑有應(yīng)答者。這表明，Th17細胞及相關(guān)細胞因子可能為RA治療提供新方向。

4.1針對Th17細胞的靶向生物制劑的臨床研究Th17細胞的分化受眾多細胞因子的調(diào)控，靶向阻斷這些細胞因子，可以抑制Th17細胞的分化及增殖，降低Th17細胞水平，減輕RA患者嚴(yán)重程度。

4.1.1托珠單抗(Tocilizumab，TCZ)TCZ是重組人源化抗IL-6R單克隆抗體，通過與IL-6R結(jié)合，抑制IL-6介導(dǎo)的信號通路。IL-6是Th17細胞分化重要的細胞因子，通過阻斷這種細胞因子途徑可減少Th17細胞水平，抑制其分化[16]。目前許多臨床試驗證明了TCZ是治療RA的一種有效藥物。有一項納入了10篇發(fā)表在PubMed及Charane圖書館的TCZ的系統(tǒng)回顧試驗，結(jié)果表明[17]：相比單用甲氨蝶呤(MTX)，單用TCZ能取得更好的療效；對MTX及TNF拮抗劑反應(yīng)不充分的患者，TCZ聯(lián)合MTX能取得更高的ACR20(ACR，美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情改善標(biāo)準(zhǔn))反應(yīng)率。Bay-Jensen等[18]認為，TCZ聯(lián)合MTX治療RA，不影響骨密度，能降低血清DKK-1(Dickkopf-1)水平，促進骨形成。因此，TCZ在全世界90多個國家已被批準(zhǔn)用于RA治療。TCZ在RA患者中耐受性良好，但在老年患者中可能缺乏有效性[19]。有研究表明，對MTX不耐受患者，單用TCZ優(yōu)于單用阿達木單抗[20]。

4.1.2托法替尼(Tofacitinib，JAK3抑制劑)Tofacitinib是一種新型的口服小分子JAK激酶抑制劑，能阻斷JAK/STAT信號通路，也能抑制T細胞的增殖和原始T細胞向Th17細胞分化[21]。有臨床研究表明[22]，對TNF抑制劑反應(yīng)不佳的RA患者，接受Tofacitinib聯(lián)合MTX治療后，ACR20百分比增加，且健康評估問卷-殘疾指數(shù)量表(HAQ-DI)、疾病活動度(DAS)評分較安慰劑組有顯著差異。有一項納入了8個臨床試驗(4個Ⅱ期試驗，4個Ⅲ期試驗)的系統(tǒng)回顧試驗，旨在評估Tofacitinib治療RA的療效及安全性。試驗結(jié)果表明[23]：Tofacitinib在3 mg以上劑量組ACR20百分比明顯增高；且不管單用或連用MTX，Tofacitinib在5、10 mg組能明顯改善患者臨床癥狀。其療效類似于阿達木單抗，常見不良反應(yīng)主要為：感染、中性粒細胞減少，高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇增高等。這是一種有前途的藥物，且口服用藥方便，減少了注射帶來的皮膚刺激等不良反應(yīng)。

4.1.3其他藥物此外，許多藥物如：MTX、Anakinara、美羅華(Ritaximab)已長期應(yīng)用于RA治療中，他們被證實對Th17細胞水平有影響。

Ritaximab是針對B淋巴細胞(CD20)的人鼠嵌合單克隆抗體，為治療RA提供新的靶向目標(biāo)。它能抑制Th17細胞的增殖及分化，減少IL-17、IL-21、IL-22的生成[24]。研究發(fā)現(xiàn)[25]，對TNF拮抗劑及DMARDs反應(yīng)不佳的活動性RA患者，Ritaximab聯(lián)用MTX與Ritaximab聯(lián)用來氟米特臨床療效無明顯差異，這為對MTX有禁忌RA患者的治療提供新的方向。阿那白滯素(Anakinara)是IL-1R拮抗劑，它通過與IL-1R結(jié)合阻斷IL-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減少關(guān)節(jié)炎癥。不管單用或聯(lián)用MTX治療活動性RA，療效及耐受性良好[26]。且研究發(fā)現(xiàn)[27]，聯(lián)用MTX治療RA，促進了調(diào)節(jié)性T細胞比例升高，降低了Th17細胞水平及血清IL-17、IL-21水平。然而，并不是所有試圖通過抑制Th17細胞分化而減少RA關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度都如上訴藥物有效。比如STA-5326是一種口服小分子，它能抑制IL-23和IL-12的產(chǎn)生；在Ⅱa期隨機雙盲概念驗證試驗中，STA-5326聯(lián)合MTX治療活動性RA，不能明顯增加ACR20百分比，且增加劑量不能改善臨床療效[28]。

眾多的臨床研究顯示了這些生物制劑治療RA的優(yōu)勢，并且為對MTX及TNF拮抗劑反應(yīng)不佳的RA患者提供了新的方向，然而，需要更為長期的數(shù)據(jù)來描述這些藥物治療RA的風(fēng)險及收益。

4.2IL-17A抑制劑的臨床研究針對IL-17A的生物制劑目前正在臨床研究中，主要包括：Ixekizumab(LY2439821)、Secukinumab(AIN457)和Brodalumab(AMG-827)。他們通過中和IL-17/IL-17R，能改善RA患者臨床癥狀，抑制關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度。

4.2.1Ixekizumab(LY2439821)Ixekizumab是一個人源化IgG4抗IL-17單克隆抗體。研究表明[29]，RA患者在傳統(tǒng)DMARDs治療基礎(chǔ)上，予以LY2439821，能明顯提高ACR20、ACR50、ACR70百分比，降低DAS28基線水平。隨后的一項Ⅱ期臨床試驗中，設(shè)置為生物制劑初治組及對TNF拮抗劑反應(yīng)不佳組，分別予以不同劑量的Ixekizumab及安慰劑。結(jié)果顯示[30]，生物制劑初治組中，30 mg的Ixekizumab相比安慰劑組，能明顯改善ACR20百分比；在TNF-IR組中，相比安慰劑，只有80 mg及以上的高劑量組能明顯提高ACR20百分比。兩組的疾病活動度-C反應(yīng)蛋白(DAS28-CRP)、臨床疾病活動指數(shù)(CDAI)、CRP較安慰劑有顯著差異。且它的安全性與其他生物制劑相似，沒有嚴(yán)重不安全問題。

4.2.2Secukinumab(AIN457)Secukinumab是一個全人源化IgG1K抗IL-17A單克隆抗體。Secukinumab能明顯提高RA患者ACR20百分比，降低DAS28及CRP水平，減少滑膜炎癥，改善臨床癥狀[31]。在一項Ⅱ期試驗中[32]，對MTX反應(yīng)不佳的RA患者接受不同劑量的Secukinumab(16周作為主要評估點)，也證實了上訴結(jié)果，且發(fā)現(xiàn)75 mg以上劑量組能明顯降低DAS28-CRP及血清CPR水平。隨即，一系列規(guī)模更大，歷時更久的臨床試驗陸續(xù)開展。在上述試驗基礎(chǔ)上，16周時ACR20有應(yīng)答者繼續(xù)接受同樣起始劑量，直至52周；沒有應(yīng)答者加大劑量。結(jié)果顯示[33]，對Secukinumab有效者經(jīng)過52周持續(xù)有效，無應(yīng)答者，隨劑量加大無明顯收益。Secukinumab治療引起的不良事件大多數(shù)為輕至中度，且與安慰劑組無明顯差異。

4.2.3Brodalumab(AMG-827)Brodalumab是一個針對IL-17受體的全人源化單克隆抗體。它應(yīng)用于銀屑病關(guān)節(jié)炎治療中能明顯增加ACR20、ACR50百分比[34]，也用于治療RA及其他免疫炎癥疾病，但研究尚少。Martin等[35]的試驗中，對MTX反應(yīng)不佳的RA患者，接受Brodalumab治療后ACR20百分比增加，藥物不良反應(yīng)與劑量遞增無明顯關(guān)系，不良事件發(fā)生率較安慰劑無明顯差異。但該試驗為Ⅰb期試驗，安全性是主要評估點，需要更多的Ⅱ期試驗來評估其療效及安全性。

IL-17在宿主防御反應(yīng)中有重要作用，所以它的抑制劑有潛在引發(fā)嚴(yán)重感染和介導(dǎo)免疫性疾病的風(fēng)險。但是，阻斷眾多細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的一些細胞因子，對于引發(fā)感染風(fēng)險較小。上訴藥物的臨床試驗報告一般耐受性良好，但這些試驗持續(xù)時間較短，仍需更進一步臨床試驗來評估更長期的療效及安全性。

5結(jié)語與展望

隨著對RA研究的深入，Th17細胞及IL-17在RA的作用受到重視。針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑通過減少Th17細胞及IL-17水平，能有效減輕關(guān)節(jié)炎癥及疾病嚴(yán)重程度，為RA的治療提供了新的方向，并且顯示出較傳統(tǒng)DMARDS及TNF-α藥物的優(yōu)勢。但是，這些藥物臨床研究時間較短，且并沒有闡明RA患者能從中受益多大，什么劑量或什么給藥方案最為合理。所以，仍需要更多的數(shù)據(jù)來評估更為長期的收益及風(fēng)險。

參考文獻

[1]Weyand CM.New insights into the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Rheumatology,2000,39(1):3-8.

[2]Hemdan NY,Birkenmeier G,Wichmann G,et al.Interleukin-17-producing T helper cells in autoimmunity[J].Autoimmun Rev,2010,9(11):785-792.

[3]Annunziato F,Romagnani S.Heterogeneity of human effector CD4+T cells[J].Arthritis Res Ther,2009,11(6):1-8.

[4]Van Den Berg WB,Mcinnes IB.Th17 cells and IL-17 A-Focus on immunopathogenesis and immunotherapeutics[J].Semin Arthritis Rheum,2013,43(2):158-170.

[5]Park JS,Park MK,Lee SY,et al.TWEAK promotes the production of Interleukin-17 in rheumatoid arthritis[J].Cytokine,2012,60(1):143-149.

[6]Zhou M,Liu R,Su DL,et al.TL1A increased the differentiation of peripheral Th17 in rheumatoid arthritis[J].Cytokine,2014,69(1):125-130.

[7]Wang W,Shao S,Jiao Z,et al.The Th17/Treg imbalance and cytokine environment in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int,2012,32(4):887-893.

[8]Al-Zifzaf DS,El BA,Mamdouh R,et al.FoxP3+T regulatory cells in Rheumatoid arthritis and the imbalance of the Treg/TH17 cytokine axis[J].Egyp Rheumatol,2015,37(1):7-15.

[9]Ishigame H,Kakuta S,Nagai T,et al.Differential roles of interleukin-17a and-17F in host defense against mucoepithelial bacterial infection and allergic responses[J].Immunity,2009,30(1):108-119.

[10]Ryu S,Lee JH,Kim SI.IL-17 increased the production of vascular endothelial growth factor in rheumatoid arthritis synoviocytes[J].Clin Rheumatol,2006,25(1):16-20.

[11]Pickens SR,Volin MV,Mandelin AM,et al.IL-17 contributes to angiogenesis in rheumatoid arthritis[J].J Immunol,2010,184(6):3233-3241.

[12]Shahrara S,Pickens SR,Mandelin IA,et al.IL-17-Mediated monocyte migration occurs partially through CC chemokine ligand 2/monocyte chemoattractant protein-1 induction[J].J Immunol,2010,184(8):4479-4487.

[13]Lubberts E,Van Den Bersselaar L,Oppers-Walgreen BA,et al.IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF-kappa B ligand/osteoprotegerin balance[J].J Immunol,2003,170(5):2655-2662.

[14]Koenders MI,Marijnissen RJ,Devesa IA,et al.Tumor necrosis Factor-Interleukin-17 interplay induces S100A8,interleukin-1 beta,and matrix metalloproteinases,and drives irreversible cartilage destruction in murine arthritis rationale for combination treatment during arthritis[J].Arthritis Rheum,2011,63(8):2329-2339.

[15]Chen DY,Chen YM,Chen HH,et al.Increasing levels of circulating Th17 cells and interleukin-17 in rheumatoid arthritis patients with an inadequate response to anti-TNF-alpha therapy[J].Arthritis Res Ther,2011,13(4):R126.

[16]Samson M,Audia S,Janikashvili N,et al.Brief report:inhibition of interleukin-6 function corrects Th17/Treg cell imbalance in patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2012,64(8):2499-2503.

[17]Navarro-Millan I,Singh JA,Curtis JR.Systematic review of tocilizumab for rheumatoid arthritis:a new biologic agent targeting the interleukin-6 receptor[J].Clin Ther,2012,34(4):788-802.

[18]Bay-Jensen AC,Platt A,Byrjalsen I,et al.Effect of tocilizumab combined with methotrexate on circulating biomarkers of synovium,cartilage,and bone in the LITHE study[J].Semin Arthritis Rheum,2014,43(4):470-478.

[19]Pers YM,Schaub R,Fortunet C,et al.Efficacy and sfety of tocilizumab in elderly patients with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,2014,73(2):689.

[20]Gabay C,Emery P,Van Vollenhoven R,et al.Tocilizumab monotherapy versus adalimumab monotherapy for treatment of rheumatoid arthritis (ADACTA):a randomised,double-blind,controlled phase 4 trial[J].Lancet,2013,381(9877):1541-1550.

[21]Maeshima K,Yamaoka K,Kubo S,et al.The JAK inhibitor tofacitinib regulates synovitis through inhibition of interferon-gamma and interleukin-17 production by human CD4+T cells[J].Arthritis Rheum,2012,64(6):1790-1798.

[22]Burmester GR,Blanco R,Charles-Schoeman C,et al.Tofacitinib(CP-690,550)in combination with methotrexate in patients with active rheumatoid arthritis with an inadequate response to tumour necrosis factor inhibitors:a randomised phase 3 trial[J].Lancet,2013,381(9865):451-460.

[23]Kaur K,Kalra S,Kaushal S.Systematic review of tofacitinib:a new drug for the management of rheumatoid arthritis[J].Clin Ther,2014,36(7):1074-1086.

[24]Van De Veerdonk FL,Lauwerys B,Marijnissen RJ,et al.The anti-CD20 antibody rituximab reduces the Th17 cell response[J].Arthritis&Rheumatism,2011,63(6):1507-1516.

[25]Narvaez J,Diaz-Torne C,Miguel Ruiz J,et al.Comparative effectiveness of rituximab in combination with either methotrexate or leflunomide in the treatment of rheumatoid arthritis[J].Semin Arthritis Rheum,2011,41(3):401-405.

[26]Furst DE.Anakinra:review of recombinant human interleukin-I receptor antagonist in the treatment of rheumatoid arthritis[J].Clin Ther,2004,26(12):1960-1975.

[27]Niu XY,He DY,Deng SH,et al.Regulatory immune responses induced by IL-1 receptor antagonist in rheumatoid arthritis[J].Mol Immunol,2011,49(1/2):290-296.

[28]Krausz S,Boumans MJ,Gerlag DM,et al.A phase Ⅱa,randomized,double-blind,placebo-controlled trial of apilimod mesylate,an interleukin-12/interleukin-23 inhibitor,in patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2012,64(6):1750-1755.

[29]Genovese MC,Van Den Bosch F,Roberson SA,et al.LY2439821,a humanized Anti-Interleukin-17 monoclonal antibody,in the treatment of patients with rheumatoid arthritis a phase Ⅰ randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled,Proof-of-Concept study[J].Arthritis Rheum,2010,62(4):929-939.

[30]Genovese MC,Greenwald M,Cho CS,et al.A phase Ⅱ randomized study of subcutaneous ixekizumab,an Anti-Interleukin-17 monoclonal antibody,in rheumatoid arthritis patients who were naive to biologic agents or had an inadequate response to tumor necrosis factor inhibitors[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(7):1693-1704.

[31]Hueber W,Patel DD,Dryja TA,et al.Effects of AIN457,a fully human antibody to interleukin-17a,on psoriasis,rheumatoid arthritis,and uveitis[J].Sci Transl Med,2010,2(52):7130-7135.

[32]Genovese MC,Durez P,Richards HB,et al.Efficacy and safety of secukinumab in patients with rheumatoid arthritis:a phase II,dose-finding,double-blind,randomised,placebo controlled study[J].Ann Rheum Dis,2013,72(6):863-869.

[33]Genovese MC,Durez P,Richards HB,et al.One-year Efficacy and Safety Results of Secukinumab in Patients With Rheumatoid Arthritis:Phase II,Dose-finding,Double-blind,Randomized,Placebo-controlled Study[J].J Rheumatol,2014,41(3):414-421.

[34]Mease PJ,Genovese MC,Greenwald MW,et al.Brodalumab,an Anti-IL17RA monoclonal antibody,in psoriatic arthritis[J].N Engl J Med,2014,370(24):2295-2306.

[35]Martin DA,Churchill M,Felipe Flores-Suarez L,et al.A phase Ib multiple ascending dose study evaluating safety,pharmacokinetics,and early clinical response of brodalumab,a human anti-IL-17R antibody,in methotrexate-resistant rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther,2013,15(5):R164.

doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.042

作者簡介：任茜(1989-)，碩士在讀，住院醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫臨床工作。△通訊作者，E-mail:13700980878@163.com。

[中圖分類號]R593.22

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1124-04

(收稿日期：2015-07-22修回日期：2015-12-15)