三倍體葡萄胚挽救育種研究現狀與展望

路鳳珍，張娜，田淑芬*，溫曉敏，陳三春（. 天津市農業科學院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業重點實驗室，天津 30092；2. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

三倍體葡萄胚挽救育種研究現狀與展望

路鳳珍1，2，張娜1，田淑芬1*，溫曉敏1，2，陳三春1，2
（1. 天津市農業科學院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

綜合分析國內外相關文獻，闡述了三倍體葡萄胚挽救技術的研究進展，探討了影響三倍體葡萄胚挽救育種成功的主要因素：親本選擇、接種時期、培養基種類等，概述了三倍體葡萄鑒定方法，馴化移栽過程中的影響因素，包括基質類型、生根粉濃度等，并對胚挽救技術在三倍體葡萄育種上的發展進行展望。

三倍體葡萄；胚挽救技術；育種；研究進展

多倍體育種是培育果樹新品種重要途徑之一，三倍體葡萄因具有無核或少核、果粒大、產量高、植株生長旺盛等優良特性，使其成為葡萄育種的目標之一，目前二倍體與四倍體進行有性雜交是獲得三倍體葡萄的有效途徑，其次還可以通過二倍體品種間雜交、自然選育、三倍體芽變、核融合、胚乳培養和花藥培養等途徑獲得三倍體葡萄品種。但在常規條件下，采用以上技術進行品種間雜交存在較嚴重的雜交障礙，往往出現坐果率低、雜種胚早期敗育、親和力差、胚乳解體或獲得三倍體雜交種子生活力較低等問題，獲得雜交后代比較困難［1-3］，使用胚挽救技術可提高其雜種后代的成活率［4］。

自1982年Ramming等［5］首次報道了利用胚挽救技術培養無核葡萄胚珠并獲得2株實生苗以來，無核葡萄胚挽救開始引起世界各國葡萄育種者的關注［6-18］。Yamashita等［4，19-20］首先利用有核四倍體葡萄和二倍體葡萄雜交，經胚珠培養，最高成苗率達42.4%，并成功獲得了三倍體植株。徐海英等［21］通過胚挽救獲得部分雜種苗，其中約23%為三倍體單株。潘春云等［22］利用胚挽救技術獲得三倍體植株，成苗率為0～5.3%。郭印山等［23］以葡萄二倍體與四倍體進行胚挽救得到三倍體植株（27.59%）。此外，李世誠等、趙艷華等、石艷等、程琳琳等［24-27］也都通過胚挽救培育出了三倍體葡萄。

在多倍體葡萄育種方面，日本已培育成功的三倍體無核葡萄品種有：尾玲（Yileyi）、戴拉王（King Dela）、蜜無核（Honey Seedless）、甲斐美領（Kai Mirei）、夏黑（Summer Black），我國選育成功的三倍體無核品種—無核早紅（Earlyred Seedless）［28］。但是，由于現在對無核性狀的遺傳規律認識還不夠深入，三倍體葡萄胚挽救育種技術尚不成熟，其胚挽救中胚的發育率、萌發率和成苗率較低仍是困擾三倍體胚挽救育種的一個難題。作者通過查閱了相關的資料，對三倍體葡萄胚挽救技術研究的進展進行總結，系統研究雜交組合的親本選擇、接種時期、培養基種類及馴化移栽方式對胚培養效果的影響等，以達到提高三倍體葡萄雜交胚萌發率和成苗率的目的。

1　三倍體葡萄胚挽救育種

1.1三倍體葡萄胚挽救育種影響因素

1.1.1親本選擇

胚挽救技術可大大縮短育種周期［4］，提高后代中無核雜種的比率［5］，可以阻止三倍體雜交幼胚的早期敗育，形成三倍體植株。而雜交組合的基因型不同，其胚挽救的成功率也將不同。

（1）母本的選擇——以二倍體葡萄為母本。在無核葡萄胚挽救過程中，選擇適宜的母本是雜交組合的關鍵。不宜采用可挽救性差的品種，如喜樂［24］、玫瑰露［1］、愛莫無核［27］等成苗率低于6%，不宜做母本。趙艷華等［29］以玫瑰香×巨峰的雜交胚珠為試材進行胚挽救研究，成苗率最高為36%。而閆愛玲等［30］以玫瑰香×京優雜交，成苗率為24.57%、秋紅×峰后雜交成苗率為35.32%。Flame Seedless［31］、Sweet Scarlet［31］、無核白［31］、無核紅寶石［23］等也是成苗率較高的品種，適宜用作母本。

（2）父本的選擇——以二倍體葡萄為父本。在無核葡萄胚挽救育種中，父本基因型對雜種成苗也有一定影響［32-33］，基因型差異導致親本親和力的不同［34］。山下裕之等［4］利用四倍體葡萄和二倍體有核葡萄雜交，經過胚珠培養最高成苗率可達42.4%。而且，四倍體葡萄為母本比二倍體為母本獲得的后代三倍體的比例高，但是二倍體為母本要比四倍體為母本的胚發育率明顯提高［19］。郭印山等［35］研究了有核葡萄二倍體與四倍體正交、反交的親和力大小，結果顯示正交的親和力大于反交的，但是雜交后代三倍體的比例卻低于反交的。楊德龍等［36］通過研究也得到同樣的結果。

1.1.2接種時期

最佳接種時期的確定是胚挽救成功的關鍵因素［37-42］之一。最佳接種時期是胚發育程度最高而尚未達到敗育的時期，在此時進行胚培養可以獲得最多數量的萌發苗［43］。張利等［16］研究證明了無核葡萄胚珠發育過程中存在一個急劇敗育期的推測，以及最適胚挽救時期與漿果開始軟化期作為接種最佳時期的研究基本一致［44］。

但目前，還沒有一個確定最佳接種時期的適用方法，大多數學者采用開花后天數作為接種時期的指標，間接地反映胚珠內胚的發育程度。不同品種間幼胚發育的進程存在差異，因此胚挽救的最佳接種時期不同。以四倍體玫瑰香為母本的胚珠萌發率分別在花后65 d和70 d最高［35］。無核白為母本的雜交胚珠在授粉后35 d接種發育率最高；巨峰為母本的雜交胚珠在授粉后55 d發育率最大［45］，過早或過晚取樣均導致成苗率降低。取樣時期的確定與母本的成熟期有很大關系，母本相同的雜交組合最佳取樣時期相差不大。徐海英等［21］研究發現，早熟品種為授粉后6～9周，中熟品種為授粉后7～10周，晚熟品種為授粉后9～12周。但在實際應用中，要考慮具體的環境條件、地理位置及氣候條件，同一品種在不同年份的最佳取樣時期也不盡相同。

1.1.3培養基

篩選適宜的培養基是獲得無核葡萄胚挽救成功的關鍵因素［32］。胚挽救過程可分為3個階段：胚珠內胚發育階段，使胚珠充分發育成萌發力較強的胚；胚萌發階段，促使幼胚萌發；成苗階段，使已萌發的胚發育成正常植株。不同階段所選用的基本培養基類型和所需營養物質不同。

（1）基本培養基。采用的基本培養基種類主要有Nitsch［54］、White、ER［27，35，38，46，47，52，54-57］、B5［48］、1/2MS、MS［24，49］、MM4［50］、NN［7，32］等。自Emershed和Ramming利用ER培養基用于胚珠發育并取得良好效果以來，Nitsch或ER作為無核葡萄胚珠發育基本培養基獲得了良好效果，而胚萌發和成苗培養基選用1/2MS或1/2B5較好［24，51］。郭印山等［53］認為二倍體與四倍體雜交胚在無機鹽濃度較低的White培養基上更有利于其發育。在試驗過程中，對于不同雜交組合，應進行多次重復試驗，以找出適合的相應培養基類型，提高胚挽救成功率。

（2）添加物。多數研究者認為，在培養基中添加適宜的外源激素對胚的發育及萌發有促進作用［6，57-59］。如在Nitsch培養基中添加IAA和GA3，對提高無核葡萄胚珠發育率起到關鍵作用［60］；IBA能促進幼胚萌發［56，61］；在MM1培養基基礎上添加甘氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和脯氨酸有利于胚的發育和成苗［62］等。劉佳等［63］在胚珠發育階段，使用ER+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3培養基最適宜離體幼胚的發育；在胚萌發階段，使用WPM+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L GA3培養基萌發率最高。激素的添加對胚發育率及成苗率也有一定的促進作用［64］。但是在唐冬梅等［54］的研究中，在ER培養基中添加IAA和GA3將抑制胚珠發育。在基本培養基中適當加入活性炭可防止漿果類胚珠培養出現褐化現象，使用濃度通常在0.1%～0.3%之間。

1.1.4培養條件

（1）光照。在三倍體葡萄胚挽救過程，多數學者在培養階段會提供適宜的光照，光質對根芽分化、葉綠體形成等都有影響。自1955年Capite最早將光因子應用于植物組織培養調控以來，有關光質在植物離體培養中的作用研究也越來越多［66］。一般光周期為12～16 h，光照強度2000 lux。蘇小玲［66］研究了不同光質對葡萄試管苗生長的影響，結合光質對幼胚和試管苗生長的影響，考慮不同光質對無核葡萄胚挽救成苗率的影響，開展相關的研究。而唐冬梅等［67］研究發現黑暗條件下有利于胚珠的發育，可能因為暗培養刺激了內源激素的分泌［68］。

（2）溫度。在胚挽救過程中，溫度可以決定呼吸速度和控制植物組織代謝過程。最適溫度范圍為23～28 ℃之間。大多數研究者在胚挽救過程采用的是恒溫培養，溫度一般控制在（25±2） ℃，也有人認為在低溫條件在對胚發育和萌發有著促進作用，Gray等［7］、Spiegle等［60］認為胚萌發需要低溫的狀態。蔣愛麗等［69］認為，大小不同的胚珠在胚珠培養階段，幼胚對低溫的反應不同，在培養“大敗育型”胚珠時，因為胚已經進入休眠，低溫處理同時附加BA，胚的萌發率最高。低溫處理一般針對的是成熟種子的萌發，低溫可打破種子休眠，促進種子萌發。而對于從正生長發育的果實中獲得的胚珠來說，是否需要經低溫處理打破休眠目前值得探討和研究［70-71］。

（3）濕度。培養過程中適宜濕度對胚挽救成功與否也很重要，在無核葡萄胚挽救培養的三個階段中，胚珠生長對濕度的要求有所不同，王躍進等［72］創建的無核葡萄胚挽救技術體系中建議胚珠接種在固液雙相培養基中，先把離體胚珠接種在固體培養基中，然后再倒入一定量的液體培養基，用量以蓋住整個胚珠為宜，這對于保持離體胚珠生長的濕度環境有很大作用，胚珠內胚的發育率較高。此外，培養基的pH值對胚的生長有明顯影響，不同品種所需pH值不同。

1.2三倍體葡萄的鑒定

1.2.1體細胞染色體計數

關于二倍體與四倍體葡萄雜交幼苗染色體倍性鑒定方法的研究，染色體計數法是最直接、最傳統、最準確的方法。現有研究表明，可以利用染色體計數法對通過胚挽救技術獲得的部分雜種苗進行鑒定［21，23，30］。

1.2.2流式細胞儀鑒定

由于葡萄染色體數目較多（2n=38），對染色體計數操作復雜且費時費力，目前快速有效地鑒別果樹染色體倍性的方法是利用流式細胞儀進行鑒定［65］，它可以直接測定細胞內的DNA含量［73-74］，從而鑒別植株的染色體倍性水平，而且利用此方法的取材部位不受限制［25］。利用流式細胞儀對試管苗的細胞內DNA的相對含量進行測定，結果表明，隨著植株倍性水平的增加，DNA的相對含量也隨之成倍增加［25，31，75］。采用流式細胞儀快速全面地進行半定量分析后，初步篩選出三倍體單株，再進一步通過染色體計數法加以直觀驗證，可較為系統地對獲得的雜種后代進行倍性的早期鑒定。

1.2.3形態學鑒定

多倍體一般表現葉片肥厚、果粒較大、葉色濃綠、氣孔保衛細胞變大、枝干較粗、花較大。如三倍體葡萄一般生長旺盛，年生長量大，果實無核和少核［76-78］。有的花而不稔［24］。從組織發生學的角度看，氣孔大小、保衛細胞大小和其內葉綠體數由分生組織的LI層衍生而來［79-81］，與倍性呈正相關關系，而氣孔密度與倍性呈負相關。花粉粒是由LII層衍生胞原組織形成［79-81］，花粉粒大小與染色體的數目呈正相關，四倍體花粉粒覆蓋層粗糙、穴狀雕紋的深度與二倍體親本有明顯的不同［82］。利用形態學鑒定法可獲得可靠的結果，但須進行重復試驗，并且對果實種子是否無核的鑒定要等到開花結果才可以進行，鑒定周期長，工作量大，并且極易受自然環境的影響［83］。

1.2.4分子輔助標記鑒定

利用分子標記輔助選擇，可以直接在DNA水平上進行分析［84］，從而提高葡萄遺傳育種效率，并可用于雜種后代早期鑒定。利用RAPD標記F1代的性狀進行早期鑒定，淘汰有核雜種［85，90］，也可以進行抗病性輔助選擇［39］和鑒定葡萄的無核性狀［89］與果實重量［88］。AFLP技術也可對突變體進行早期鑒定［86］。王躍進等［87］利用葡萄無核基因DNA探針對無核葡萄品種進行檢測，并初步應用于輔助育種。與形態學鑒定法相比，分子輔助標記法不僅可以提高選擇的準確率，而且不必等到植株開花結果，在幼苗時期就可以進行［91］，但需要分子引物，試驗過程比流式細胞儀復雜。

1.3影響馴化移栽的因素

較多報道只是涉及實驗室試管育苗的結果，而關于試管苗的馴化移栽的研究較少。葡萄胚挽救苗馴化移栽的過程是一個由半異養到自養、高濕到低濕、恒溫到變溫、無菌到有菌的過程［92-94］，試管苗的生理特性和組織結構與大氣環境中生長的植株有較大差別，如葉表面角質層較薄，氣孔開度大且無開閉功能，柵欄組織發育不完善，細胞間隙較大等，因此，煉苗移栽時易過度失水萎蔫，移栽成活率普遍較低，甚至不能成活［95-96］。若要獲得較高的移栽成活率，需要馴化移栽過程中的各環節達到最佳搭配。

1.3.1基質類型

合理配制移栽基質是影響試管苗馴化移栽成活的關鍵因素，任杰等［97］試驗表明，采用基質分層技術（即上層選用孔隙度大、透氣好的蛭石或珍珠巖，下層選用保墑性能好的田間土）進行移栽，胚挽救苗的成活率顯著高于使用單種特定基質。李玉玲等［98］以椰糠作為移栽基質的組成部分，其可改善透氣性，促進根系毛根的生長，能顯著提高葡萄胚挽救苗的成活率。紀薇等［99］認為珍珠巖∶草炭∶園土=4∶1∶1作為基質的移栽效果較好。

1.3.2生根粉濃度

蘸取一定濃度的生根粉溶液可以提高馴化移栽的成活率。王剛等［84］認為1.0 mg/L生根粉溶液浸泡根系3 min，植株各項生理指標較好且成活率最高。紀薇等［100］研究結果表明，蘸取濃度為200 mg/kg的生根粉（ABT10）30 s+培養室煉苗15 d+溫室煉苗15 d的移栽方式較好。

2　展望

培育大粒、無核、優良抗性的三倍體葡萄是葡萄育種的主要目標之一，利用胚挽救技術將葡萄二倍體與四倍體的雜交胚進行離體培養，大大縮短育種年限且極大地提高了三倍體葡萄的育種效率。隨著現代生物技術的不斷發展和研究的不斷深入，胚挽救技術結合分子生物學技術將會大大提高葡萄品種的選育效率。天津市農科院葡萄研究中心利用分子生物技術和田間選種結合的方法從天津漢沽種植的茶淀玫瑰香葡萄中鑒別篩選出的玫瑰香優系葡萄，較普通葡萄香氣濃郁，以此為親本，利用胚挽救可選育優質的三倍體葡萄，該項技術也會日趨成熟和完善。

［1］ 徐海英， 閻愛玲， 張國軍. 葡萄二倍體與四倍體品種間雜交胚珠的離體培養［J］. 果樹學報， 2001， 18（6）： 317-320.

［2］ 郭印山， 郭修武， 李坤， 等. 葡萄不同倍性品種間雜交親和性和后代染色體變異的研究［J］. 沈陽農業大學學報， 2004， 35（3）： 192-194.

［3］ 趙勝建， 郭紫娟. 三倍體無核葡萄育種研究進展［J］. 果樹學報，2004， 21（4）： 360-364.

［4］ YAMASHITA H， HORIUCHI S， TAIRA T. Development of seeds and the growth of triploid seedlings obtained from reciprocal crosses between diploid and tetraploid grapes ［Vitis］［J］. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science （Japan）， 1993， 62（2）： 249-255.

［5］ RAMMING D W， EMERSHAD R L. In-ovule embryo culture of seeded and seedless Vitis vinifera（Abst）［J］. HortSeience， 1982， 17（3）： 487.

［6］ GRAY D J， FISHER L C， MORTENSEN J A. Comparison of methodologies for in ovulo embryo rescue of seedless grapes［J］. HortScience （USA）， 1987， 22（6）： 1334-1335.

［7］ GRAY D J， MORTENSEN J A， BENTON C M， et al. Ovule culture to obtain progeny from hybrid seedless bunch grapes［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 1990， 115（6）： 1019-1024.

［8］ Gray D J， Hanger L A. Effect of ovule maturity on recovery of zygotic embryos and embryogenic cultures from muscadine grape［J］. HortScience， 1993， 28（3）： 227-227.

［9］ BARLASS M， DAVIS H P， RAMMING D W. In-ovulo embryo culture： a breeding technique to rescue seedless x seedless table grape crosses［J］. Australian Grapegrower and Winemaker， 1988， 259： 123-125.

［10］ BOUQUET A， DAVIS H P. In vitro ovulo and embryo culture for breeding seedless table grapes （Vitis vinifera L.）［intraspecific hybridization， stenospermocarpy， polyembryony］［J］. Agronomie （France）， 1989， 9： 565-574.

［11］ BURGER P， GOUSSARD P G. In vitro culture of ovules and embryos from seedless grapes （Vitis vinifera L.）［J］. South African Journal for Enology and Viticulture， 1996， 17： 31-37.

［12］ VALDEZ J G. Immature embryo rescue of grapevine （Vitis vinifera L.） after an extended period of seed trace culture［J］. VITISJournal of Grapevine Research， 2015， 44（1）： 17.

［13］ BHARATHY P V， KARIBASAPPA G S， PATIL S G， et al. In ovulo rescue of hybrid embryos in Flame Seedless grapes—Influence of prebloom sprays of benzyladenine［J］. Scientia horticulturae， 2005， 106（3）：353-359.

［14］ 能塚一徳， 鶴丈和， 白石美樹夫. Seedless-Seedless Grape Hybridization via In-Ovulo Embryo Culture［J］. 園蕓學會雑誌， 2001，70（1）： 7-15.

［15］ Boz Y， ?zer C， Kebeli N. Studies on the applying of embryo culture in breeding new hybrids by crossing seedless grape cultivars［C］//XXVI International Horticultural Congress：Biotechnology in Horticultural Crop Improvement： Achievements，Opportunities and Limitations， 2003， 625： 279-281.

［16］ 張利， 孟新法. 無核葡萄胚珠發育及早期離體培養的研究： Ⅱ.無核葡萄胚發育的特點［J］. 北京農業大學學報， 1991， 17（4）： 55-59.

［17］ 亓桂梅. 無核葡萄雜種胚珠的培養及萌發成苗的若干影響因素［J］. 中外葡萄與葡萄酒， 2001（4）： 24-27.

［18］ 王飛， 王躍進， 周建錫. 無核葡萄與中國野生葡萄雜種的胚挽救技術研究［J］. 園藝學報， 2006， 33（5）： 1079-1082.

［19］ YAMASHITA H， HANIUDA T， SHIBA H. In vitro culture of embryos obtained by crossing tetraploid grape cultivar Kyoho with diploid cultivars［J］. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science （Japan）， 1995， 63（4）： 719-724.

［20］ YAMASHITA H， SHIGEHARA I， HANIUDA T. Production of triploid grapes by in ovulo embryo culture［J］. VITIS-Journal of Grapevine Research， 2015， 37（3）： 113.

［21］ 徐海英， 閆愛玲， 張國軍. 葡萄二倍體與四倍體品種間雜交胚挽救接種時期的確定［J］. 中國農業科學， 2005， 38（3）： 629-633.

［22］ 潘春云， 亓桂梅， 湯小寧. 葡萄三倍體育種初報［J］. 山東農業大學學報， 1998， 29（3）： 299-302.

［23］ 郭印山， 陳文玲， 郭修武， 等. 二倍體與四倍體葡萄品種雜交胚挽救及后代倍性鑒定［J］. 沈陽農業大學學報， 2014， 45（3）： 274-278.

［24］ 李世誠， 金佩芳. 與四倍體雜交的無核葡萄胚珠培養獲得三倍體植株［J］. 上海農業學報， 1998， 14（4）： 13-17.

［25］ 趙艷華， 程和禾， 吳雅琴， 等. 三倍體葡萄種質創新及倍性快速鑒定［J］. 園藝學報， 2011， 8（6）： 1161-1166.

［26］ 石艷， 張劍俠， 王躍進， 等. 利用胚挽救技術創制葡萄多倍體種質的研究［J］. 果樹學報， 2012， 29（2）： 269-273.

［27］ 程琳琳， 王躍進， 張劍俠， 等. 胚挽救技術進行無核葡萄及三倍體新種質創制［J］. 熱帶作物學報， 2012， 33（9）： 1584-1589.

［28］ 趙勝建， 郭紫娟， 趙淑云， 等. 三倍體葡萄新品種無核早紅［J］.園藝學報， 2000， 27（2）： 155.

［29］ 趙艷華， 吳雅琴， 趙勝建， 等. 二倍體與四倍體葡萄品種間雜交胚搶救研究［J］. 華北農學報， 2005， 20（6）： 110.

［30］ 閆愛玲， 張國軍， 徐海英. 葡萄不同倍性品種的雜種胚挽救及鑒定［J］. 北方園藝， 2008（7）： 28-30.

［31］ 王素月， 師校欣， 楊麗麗， 等. 葡萄無核二倍體與四倍體雜交胚挽救及后代倍性分析［J］. 河北農業大學學報， 2014， 37（5）： 55-60.

［32］ PONCE M T， AGUERO C B， GTEGORI M T， et al. Factors affecting the development of stenospermic grape（Vitis vinifera）embryo cultured invitro［J］. Acta Horticulturae， 2000（528）： 667-672.

［33］ GOLDY R G， AMBORN U. In vitro culturability of ovules from 10 seedless grape clones［J］. HortScience （USA）， 1987， 22（5）： 952.

［34］ GOLDY R， EMERSHAD R， RAMMING D， et al. Embryo culture as a means of introgressing seedlessness from Vitis vinifera to V. rotundifolia［J］. HortScience （USA）， 1988， 23（5）： 886-889.

［35］ 郭印山， 郭修武， 張海娥， 等. 利用胚挽救技術獲得三倍體葡萄植株研究［J］. 沈陽農業大學學報， 2005， 36（5）： 606-608.

［36］ YANG D， LI W， LI S， et al. In vitro embryo rescue culture of F1 progenies from crosses between diploid and tetraploid grape varieties［J］. Plant Growth Regulation， 2007， 51（1）： 63-71.

［37］ RAMMING D W， EMERSHAD R L， TARAILO R. A stenospermocarpic， seedless Vitis vinifera×Vitis rotundifolia hybrid developed by embryo rescue［J］. HortScience， 2000， 35（4）： 732-734.

［38］ 郭海江， 王躍進， 張劍俠， 等. 葡萄抗病無核胚挽救育種及分子標記輔助選擇［J］. 西北植物學報， 2005， 25（12）： 2395-2401.

［39］ 郭修武， 郭印山， 張海娥， 等. 接種時期和培養基對無核葡萄胚挽救的影響［J］. 園藝學報， 2007， 34（2）： 329-332.

［40］ 金釗， 賈琢， 王冬. 無核葡萄胚挽救技術初探［J］. 北方果樹，2009（1）： 13-15.

［41］ JI W， LI Z， ZHOU Q， et al. Breeding new seedless grape by means of in vitro embryo rescue［J］. Genetics and Molecular Research， 2013， 12（1）： 859-869.

［42］ GUO Y， ZHAO Y， LI K， et al. In vitro embryo rescue culture of F1 progenies from crosses between tetraploid grape and Vitis amurensis Rupr［J］. African Journal of Agricultural Research， 2011， 6（21）： 4906-4909.

［43］ TUKEY H B. Artificial culture of sweet cherry embryos［J］. Journal of Heredity， 1933， 24（1）： 7-12.

［44］ 孟新法， 張利， 張潞生， 等. 無核葡萄胚發育及早期離體培養的研究： Ⅳ. 胚珠接種時期對胚發育的影響［J］. 北京農業大學學報，1993， 19（1）： 45-47.

［45］ 潘儼， 廖康. 不同取胚時期對葡萄雜交胚培養的影響［J］. 新疆農業科學， 2006， 43（6）： 459-462.

［46］ CAIN D W， EMERSHAD R L， TARAILO R E. In-ovulo embryo culture and seedling development of seeded and seedless grapes （Vitis vinifera L.）［J］. Vitis， 1983， 22（1）： 9-14.

［47］ RAMMING D W. The use of embryo culture in fruit breeding［J］. HortScience， 1990， 25（4）： 393-398.

［48］ 朱林， 李佩芬， 盧炳芝， 等. 無核葡萄品種的胚珠培養和胚分化（簡報）［J］. 植物生理學通訊， 1992， 28（4）： 273-274.

［49］ GARCIA E， MARTINE A， GARCIA DLCE， et al. In vitro culture of ovules and embryos of grape for the obtention of new seedless table grape cultivars［J］. Acta Horticulturae， 2000， 25（528）：663-666.

［50］ 王愛玲， 王躍進， 唐冬梅， 等. 提高無核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究［J］. 中國農業科學， 2010， 43（20）： 4238-4245.

［51］ 董曉玲， 賀普超. 無核葡萄楊格爾的胚發育及胚珠培養［J］. 果樹科學， 1991， 8（2）： 87-90.

［52］ 李桂榮， 王躍進， 唐冬梅， 等. 無核白葡萄胚挽救育種技術研究［J］. 西北植物學報， 2001， 21（3）： 432-436.

［53］ 郭印山， 郭修武， 張海娥， 等. 葡萄二倍體和四倍體雜交胚挽救的影響因素［J］. 果樹學報， 2006， 23（1）： 115-117.

［54］ 唐冬梅， 王躍進， 趙榮華， 等. 無核葡萄胚挽救中影響胚發育的因子［J］. 中國農業科學， 2009， 42（7）： 2449-2457.

［55］ 郝燕， 楊瑞， 王鴻， 等. 無核葡萄剝胚胚挽救技術關鍵影響因子［J］. 西北農業學報， 2013， 22（9）： 114-120.

［56］ EMERSHAD R L， RAMMING D W. Somatic embryogenesis and plant development from immature zygotic embryos of seedless grapes （Vitis vinifera L.）［J］. Plant Cell Reports， 1994， 14（1）： 6-12.

［57］ TIAN L， WANG Y， NIU L， et al. Breeding of disease-resistant seedless grapes using Chinese wild Vitis spp.： I. In vitro embryo rescue and plant development［J］. Scientia horticulturae， 2008， 117（2）： 136-141.

［58］ 劉三軍， 蒯傳化， 于巧麗， 等. 葡萄無核性狀遺傳與胚挽救技術的研究及應用［J］. 果樹學報， 2009， 26（1）： 71-76.

［59］ SINGH N V， SINGH S K， SINGH A K. Standardization of embryo rescue technique and bio-hardening of grape hybrids （Vitis vinifera L.） using Arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） under subtropical conditions［J］. VITIS-Journal of Grapevine Research， 2015，50（3）： 115.

［60］ SPIEGEL-ROY P， SAHAR N， BARON J， et al. In vitro culture and plant formation from grape cultivars with abortive ovules and seeds［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 1985， 110（1）： 109-112.

［61］ 夏培蓓， 伍新宇， 代培紅， 等. 木納格葡萄胚挽救影響因素的研究［J］. 新疆農業大學學報， 2012， 35（4）： 294-297.

［62］ 潘學軍. 無核抗病葡萄胚挽救技術體系優化及新品系培育［D］. 楊凌： 西北農林科技大學， 2005.

［63］ 劉佳， 劉曉， 陳建， 等. 金星無核葡萄胚挽救影響因素的研究［J］. 西南農業學報， 2013（1）： 294-298.

［64］ 趙凱， 劉巧， 張劍俠， 等. 抗寒無核葡萄胚挽救影響因素的研究［J］. 北方園藝， 2013（17）： 11-15.

［65］ KELLER W A， ARMSTRONG K C. Production of antherderived dihaploid plants in autotetraploid marrowstem kale （Brassica oleracea var. acephala）［J］. Canadian Journal of Genetics and Cytology， 1981， 23（2）： 259-265.

［66］ 唐冬梅， 蔡軍社， 駱強偉， 等. 用于無核葡萄選育的胚挽救技術研究［J］. 果樹學報， 2008， 25（3）： 316-321.

［67］ 趙密珍， 蘇家樂， 錢亞明， 等. 紅寶石無核葡萄胚珠培養成苗技術研究［J］. 果樹學報， 2005， 22（2）： 166-168.

［68］ 蘇小玲. 不同光質對葡萄試管苗生長及內源激素含量變化的影響［D］. 蘭州： 甘肅農業大學， 2009.

［69］ 蔣愛麗， 李世誠. 大敗育型無核葡萄胚珠培養成苗技術研究［J］. 上海交通大學學報： 農業科學版， 2002， 20（1）： 45-48.

［70］ AGUERO C， GREGORI M T， PONCE M T， et al. Improved germination of stenospermic grape fertilized ovules by low temperatures［J］. Biocell， 1996， 20（2）： 123-126.

［71］ ANDERSON N， BYRNE D H， SINCLAIR J， et al. Cooler temperature during germination improves the survival of embryo cultured peach seed［J］. HortScience， 2002， 37（2）： 402-403.

［72］ 王躍進， 張劍俠， 李桂榮. 采用胚挽救技術獲得抗病無核葡萄新材料的研究［J］. 甘肅農業大學學報， 2001， 36（9）： 105-110.

［73］ GALBRAITH D W， HARKINS K R， MADDOX J M， et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues［J］. Science， 1983， 220（4601）： 1049-1051.

［74］ ARUMUGANATHAN K， EARLE E D. Estimation of nuclear DNA content of plants by flow cytometry［J］. Plant molecular biology reporter， 1991， 9（3）： 229-241.

［75］ 吳雅琴， 趙艷華， 程和禾， 等. 流式細胞術檢測葡萄倍性的研究［C］//中國園藝學會第七屆青年學術討論會論文集， 2006： 182-185.

［76］ MATSUMOTO R， KANATO K， OZAWA T. New grape cultivar" Honey Seedless"［J］. Bulletin of the Fruit Tree Research Station， 1993， 25： 45-56.

［77］ BESSHO H， MIYAKE M， KONDO M. Grape breeding in Yamanashi， Japan-present and future［C］//Eucarpia symposium on Fruit Breeding and Genetics， 1999， 538： 493-496.

［78］ 趙勝建， 趙淑云， 郭紫娟. 三倍體葡萄新品種無核早紅及配套栽培技術［J］. 河北果樹， 1998（3）： 30-3l.

［79］ 石蔭坪， 王強生. 果樹的多倍體［J］. 園藝， 1983（2）： 6-12.

［80］ SATINA S， BLAKESLEE A F， AVERY A G. Demonstration of the three germ layers in the shoot apex of Datura by means of induced polyploidy in periclinal chimeras［J］. American Journal of Botany， 1940，27（10）： 895-905.

［81］ DERMEN H， BAIN H F. A general cytohistological study of colchicine polyploidy in cranberry［J］. American Journal of Botany，1944， 31（8）： 451-463.

［82］ 唐曉萍， 陳俊， 馬小河， 等. 葡萄新品種早黑寶的倍性結構鑒定［J］. 果樹學報， 2006， 23（3）： 384-387.

［83］ 唐冬梅. 無核葡萄雜交胚挽救新種質創建與技術完善［D］. 西北農林科技大學， 2010.

［84］ 方宣鈞， 吳為人， 唐紀良， 等. 作物DNA標記輔助育種［M］. 科學出版社， 2001.

［85］ STRIEM M J， BEN-HAYYIM G， SPIEGEL-ROY P. Identifying molecular genetic markers associated with seedlessness in grape［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 1996，121（5）： 758-763.

［86］ SCOTT K D， ABLETT E M， LEE L S， et al. AFLP markers distinguishing an early mutant of Flame Seedless grape［J］. Euphytica，2000， 113（3）： 243-247.

［87］ 王躍進， 楊英軍， 周鵬， 等. 用DNA探針檢測我國栽培的無核葡萄及輔助育種初探［J］. 園藝學報， 2002， 29（2）： 105-108.

［88］ RYAN F J， RAMMING D W. Application of a Molecular Marker for Berry Seed Size to Two Populations of Grapevines （Vitis sp.） Developed in a Breeding Program［J］. HortScience， 2005， 40（4）：1069-1069.

［89］ 李金月， 王飛， 王躍進， 等. 無核葡萄與有核葡萄胚挽救雜交后代的抗寒性研究［J］. 西北農業學報， 2008， 17（6）： 113-118.

［90］ AKKURT M， CAKIR A， SHIDFAR M， et al. Using seedlessnessrelated molecular markers in grapevine breeding for seedlessness via marker-assisted selection into Muscat of Hamburg Sultani progeny［J］. Turkish Journal of Biology， 2013， 37（1）： 101-105.

［91］ LAHOGUE F， THIS P， BOUQUET A. Identification of a codominant scar marker linked to the seedlessness character in grapevine［J］. Theoretical and Applied Genetics， 1998， 97（5/6）： 950-959.

［92］ SUTTER E G. Morphological， physical and chemical characteristics of epicuticular wax on ornamental plants regenerated in vitro［J］. Annals of Botany， 1985， 55（3）： 321-329.

［93］ SUTTER E， LANGHANS R W. Formation of epicuticular wax and its effect on water loss in cabbage plants regenerated from shoottip culture［J］. Canadian Journal of Botany， 1982， 60（12）： 2896-2902.

［94］ 潘學軍， 王躍進， 張劍俠， 等. 葡萄胚挽救苗移栽技術的研究［J］. 西北植物學報， 2004， 24（6）： 1077-1082.

［95］ 柏新富， 張萍， 蔣小滿， 等. 一品紅組培苗移栽期葉片生理與解剖變化［J］. 林業科學， 2005， 41（6）： 170-173.

［96］ 曹孜義， 季唯， 強維亞， 等. 葡萄試管苗在移栽過程中葉解剖和根系活力的變化［J］. 果樹科學， 1992， 9（2）： 81-86.

［97］ 任杰， 徐彥平. 葡萄胚挽救試管苗配套優化移栽技術研究［J］.農業科學研究， 2009， 30（4）： 91-93.

［98］ 李玉玲， 伍國紅， 孫鋒， 等. 新疆鄯善地區葡萄胚挽救苗移栽技術［J］. 中外葡萄與葡萄酒， 2011（5）： 28-30.

［99］ 王剛， 李桂榮， 王躍進， 等. 無核葡萄胚挽救試管苗馴化移栽體系優化［J］. 西北農林科技大學學報： 自然科學版， 2015， 43（8）： 153-158.

［100］ 紀薇， 高美英， 張鵬飛， 等. 無核葡萄胚挽救苗的馴化及移栽技術［J］. 山西農業大學學報（自然科學版）， 2015， 35（2）： 147-150.

10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.038

2016-07-21

天津市農業科學院院長基金（15010）。

路鳳珍（1990-），女，在讀研究生，研究方向葡萄遺傳育種。

田淑芬（1966-），女，博士，研究員，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net