異常黏液質成熟劑顆粒對APP/PS1轉基因小鼠行為學和海

塔依爾?吐爾松 買吾拉尼江?依孜布拉 買地尼也提?尼亞孜 等

摘要：目的 觀察異常黏液質成熟劑顆粒對APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶、海馬CA1區組織病理形態學變化的影響，探討其作用機制。方法 選取3月齡APP/PS1轉基因模型小鼠并將其隨機分為模型組、陽性藥組和異常黏液質成熟劑高、中、低劑量組，每組18只。另取18只3月齡C57BL/6J小鼠作為正常組。各給藥組給予相應藥物灌胃，連續6個月。Morris水迷宮實驗觀察小鼠學習和記憶能力；HE染色光鏡下觀察海馬CA1區病理形態；透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區有髓神經髓鞘、微管、微絲。結果 水迷宮實驗結果顯示，模型組小鼠逃避潛伏期時間較正常組明顯延長（P<0.01），空間搜索實驗穿越原平臺位置次數較正常組明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，異常黏液質成熟劑除低劑量組第1日外其余各劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05，P<0.01），異常黏液質成熟劑低、高劑量組小鼠經過有效區域次數明顯增加（P<0.05，P<0.01），異常黏液質成熟劑各劑量組小鼠原平臺所在象限停留時間明顯增加（P<0.01）。HE染色顯示，異常黏液質成熟劑各組小鼠腦組織海馬CA1區，錐體細胞層完整性稍好，細胞排列整齊，形態正常，均勻分布；電鏡觀察，與模型組比較，異常黏液質成熟劑各組小鼠海馬CA1區神經元核形不規則，核膜清楚，染色質清晰，核仁明顯，細胞基質均勻，細胞器豐富，分布均勻，線粒體嵴明顯，粗面內質網和游離核糖體多見。結論 異常黏液質成熟劑顆?？筛纳艫PP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力，減輕神經元超微結構受損。

關鍵詞：異常黏液質成熟劑顆粒；APP/PS1轉基因小鼠模型；空間學習記憶；海馬CA1區

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）04-0041-04

Effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on Behavioristics and Hippocampus Pathomorphism of APP/PS1 Transgenic Mice TURSUN Tayerjan1， HIZBULLA Mawlanjan1， NIYAZI Maidiniyeti2， SHAWUTI Shadike3， AMAT Nurmuhammat1 （1. Uygur Medical School， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 3. Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on spatial learning and memory， histopathology morphological change in hippocampus CA1 zone； To discuss its mechanism of action. Methods Three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into 5 groups： model control group， positive control （donepezil 0.92 mg/kg） group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups （3， 2， 1.5 g/kg）， 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/ 6J mice were chosen as normal control group. All administration groups received relevant medicine for successive 6 months. Then the changes in learning and memory ability of mice were detected by Morris water maze test； pathomorphism in hippocampus CA1 zone was detected by HE staining method； changes of myelin sheath， microtubule， and

基金項目：教育部新世紀優秀人才計劃（NCET-11-1073）

通訊作者：努爾買買提·艾買提，E-mail：Oglan1972@126.com

microfilament in myelinated nerve of hippocampus CA1 zone were detected by electron microscope. Results Morris water maze test results showed that escape incubation period of APP/PS1 transgenic mice was significantly longer than the normal control group （P<0.01）， and the original platform time was significantly shorter than normal control group （P<0.01）； compared with model control group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules treatment groups escape latency time was significantly reduced （P<0.05， P<0.01）. Space experiments and escape incubation period of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups were significantly shortened （P<0.05， P<0.01）， and spatial searching test showed that the times of mice in Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups passing through effective area increased （P<0.01）. The integrity of HE staining pyramidal cell layer in the hippocampus CA1 zones of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups was relatively good； cells arranged orderly； distribution was normal. Electron microscopic observation showed that compared with model control group， the hippocampus neurons nuclear had irregular shape； nuclear membrane was clear and complete； chromatin was clear； nucleolus was obvious； cell matrix was uniform； organelles were abundant； mitochondrial cristae was obvious； endoplasmic reticulum and free ribosomes were obvious. Conclusion Abnormal Phlegmatic Temperament Granules can improve spatial learning and memory in APP/PS1 mice， alleviate neuronal ultrastructure damage and ultimately improve cognitive function.

Key words： Abnormal Phlegmatic Temperament Granules； APP/PS1 double transgenic mice model； spatial learning and memory； hippocampus CA1 zone

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），是以記憶力喪失、認知功能障礙為主要臨床特征的神經退行性障礙疾病。近年來，AD的患病率和死亡率呈上升趨勢，加之晚期AD患者常伴有嚴重認知功能障礙和精神異常癥狀，由此帶來的社會、家庭、經濟及公共衛生問題將會越來越嚴重。AD屬維醫中異常體液導致的“失憶”“失眠”“愚蠢”“遺忘”等范疇。在早期的輕度認知功能障礙期，異常黏液質在臨床表現中占主要的地位[1]。臨床上異常黏液質成熟劑對AD早期療效較好。本實驗觀察該藥對APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力和海馬CA1區組織病理形態學變化的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級APP/PS1轉基因AD模型小鼠90只，雄性，3月齡，體質量23～27 g；SPF級C57BL/6J小鼠18只，雄性，3月齡，體質量23～27 g；北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0004。小鼠飼養于新疆醫科大學實驗動物中心，飼養環境為SPF級。

1.2 藥物

異常黏液質成熟劑顆粒由新疆醫科大學維吾爾醫學院提供；鹽酸多奈哌齊片，衛材（中國）藥業有限公司，批號061653928914，使用前粉碎，用蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染液、4%多聚甲醛、50%戊二醛和白色素，南京建成生物有限公司。MT-200Morris視頻分析和跟蹤系統（成都泰盟科技有限公司），100 ℃水浴鍋（常州國華電器有限公司），BS-1105型電子天平（北京賽多克斯天平有限公司），CX-3雙目顯微鏡（日本OLYMPUS公司），DM300圖像采集系統（德國Laica公司），1230透射電鏡（日本JEOL公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

將90只轉基因小鼠隨機分為模型組、異常黏液質成熟劑高、中、低劑量組和陽性藥組，每組18只；同時以18只同月齡C57BL/6J小鼠作為正常組。依據異常黏液質成熟劑的臨床應用劑量換算成小鼠給藥劑量，即異常黏液質成熟劑低、中、高劑量組分別按1.5、2、3 g/（kg·d）灌胃異常黏液質成熟劑顆粒，陽性藥組予0.92 mg/（kg·d）多奈哌齊灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積1 g/0.1 mL。各組小鼠給藥6個月后，做行為學實驗。實驗階段所有小鼠均正常飲食、飲水，每日1次。

2.2 行為學檢測

水迷宮實驗測試包括定位航行實驗和空間搜索實驗。定位航行實驗持續4 d，記錄每只小鼠60 s內找到平臺的時間，每日4次，不同象限入池，當小鼠上到平臺后終止5 s記錄，休息10～20 min后進行第2次實驗。空間搜索實驗記錄小鼠60 s內停留于原始平臺位置的時間，觀察并記錄小鼠通過原始平臺位置的次數[2]。

2.3 組織形態學檢測

行為學檢測結束后快速脫頸處死小鼠并取腦組織，貼上標記，投入含20%蔗糖多聚甲醛固定液后固定24 h以上。室溫下切片，經二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ10 min→無水乙醇→95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ→80%乙醇，水洗，蘇木素染10 min，鹽酸乙醇分化，水沖洗回藍，伊紅染5 min后水洗，再由低至高乙醇脫水，封片，光鏡下觀察海馬CAl區病理形態。

2.4 細胞超微結構檢測

取海馬CA1區腦組織，切成1 mm3，放入4%戊二醛固定液內固定2 h，PBS沖洗10 min×3次→1%鋨酸固定2 h→PBS沖洗10 min×3次→脫水→包埋，制成超薄切片，染色后透射電鏡觀察。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 異常黏液質成熟劑顆粒對APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力的影響

定位航行實驗模型小鼠逃避潛伏期時間較正常組明顯延長（P<0.01），異常黏液質成熟劑除低劑量組第1日外其余各劑量組小鼠逃避潛伏期時間較模型組明顯縮短（P<0.05，P<0.01）；空間搜索實驗模型組小鼠穿越原平臺位置次數較正常組明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，異常黏液質成熟劑低、高劑量組小鼠經過有效區域次數明顯增加（P<0.05，P<0.01），異常黏液質成熟劑各劑量組原平臺所在象限停留時間明顯增加（P<0.01）。結果見表1、表2。

4.2 異常黏液質成熟劑顆粒對APP/PS1轉基因小鼠腦組織海馬CA1區細胞形態學的影響

光鏡觀察正常組小鼠HE染色錐體細胞核排列整齊，海馬神經元結構完整，形態正常，分布均勻，數量較多，核異染色質少，顏色淺，胞體胞漿淡藍色，細胞核核仁大而清楚，胞質豐富，無核固縮或溶解現象，核膜清晰，可見少量神經膠質細胞，但無膠質細胞增生的情況；模型組小鼠HE染色可見神經元數目減少、變性、壞死，錐體細胞排列紊亂，細胞縮小，核固縮，形態無規則，膠質細胞增生；陽性藥組小鼠HE染色錐體細胞核排列整齊緊密，海馬神經元結構完整，數量較多，形態正常，分布均勻，核異染色質少，顏色淺，胞體胞漿淡藍色，胞質豐富，無核固縮或溶解；異常黏液質成熟劑低劑量組小鼠HE染色仍見錐體細胞帶紊亂、變細，細胞體積縮小，細胞間隙大，與模型組比較有所改善；異常黏液質成熟劑中劑量組小鼠HE染色可見少量分散的神經元凋亡細胞，神經元數量增多，錐體細胞紊亂減少，細胞體積增大、核固縮減輕；異常黏液質成熟劑高劑量組小鼠HE染色見細胞排列整齊，錐體細胞層較完整，形態正常，結構緊密，分布均勻，胞體胞漿淡藍色，細胞核大而清楚，胞質豐富，可見少量的神經元固縮狀壞死，核膜清晰，可見少量的神經膠質細胞，但無膠質細胞增生的情況。結果見圖1。

4.3 異常黏液質成熟劑顆粒對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織海馬CA1區細胞超微結構的影響

透射電鏡觀察正常組小鼠海馬神經元核圓形，核膜完整清晰，染色質清晰，核仁明顯，細胞基質密度均勻，細胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內質網和游離的核糖體；模型組小鼠神經核形狀不規則，可見異染色質和核仁邊集，細胞基質密度稍微降低，部分線粒體微腫脹、線粒體基質密度降低，粗面內質網擴張；陽性藥組小鼠海馬神經元核圓形，核膜清楚完整，染色質細膩，部分神經元細胞核形不規則；細胞基質密度均勻一致，細胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內質網和游離的核糖體，粗面內質網稍擴張；異常黏液質成熟劑低劑量組小鼠神經元細胞核形狀極不規則，異染色多，細胞基質密度略降低，個別線粒體輕微腫脹、空泡變，粗面內質網擴張；異常黏液質成熟劑中劑量組小鼠海馬神經元核圓形，核膜清楚完整，染色質細膩，核仁明顯，細胞基質密度均勻一致，細胞器豐富，均勻分布，線粒體形態基本正常，游離核糖體多，內質網略擴張，細胞可見少量脂褐素；異常黏液質成熟劑高劑量組小鼠海馬神經元核形不規則，核膜完整清晰，染色質清晰，核仁明顯；細胞基質密度均勻，細胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內質網和游離的核糖體。結果見圖2。

5 討論

AD是一種與年齡相關、不可逆的神經退行性疾病，以漸進和永久失去學習記憶能力為主要特點，最初呈現輕度認知功能障礙，逐漸發展到嚴重的記憶功能缺損[3]，疾病后期常常出現抑郁、焦慮和易怒等異常精神癥狀[4]，其病因包括APP、PS1基因的突變[5]。AD引起的神經元損害已經被認可是一種重要的病理特征，在研究和開發轉基因小鼠的過程中起重要的作用[6]。

治療AD的常用西藥有膽堿酯酶抑制劑、抗Aβ治療的分泌酶抑制劑、非甾體類抗炎藥、神經營養因子類藥物等，但這些藥物尚無任何一種可完全有效治療AD。維醫認為，大腦是濕寒性臟器，黏液質屬性也是濕寒，其中澀味黏液質是黏液之中混入黑膽質的異常體液，分量重、質地稠，作為大腦病理產物在大腦中沉淀，從不同途徑和（或）不同程度上損傷神經組織，影響正常細胞生理功能，易于形成神經阻滯，進而引起相應的神經功能障礙和AD等神經系統疾病。異常黏液質成熟劑具有成熟異常黏液質、消炎解毒等功效。該藥藥性干熱，成熟異常黏液質體液，糾正由異常黏液質導致的人體機能的異常狀態，以維持人體體液的相對平衡。

本實驗研究結果顯示，通過異常黏液質成熟顆粒治療后，定位航行實驗小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短?？臻g搜索實驗小鼠經過有效區域次數增加，提示異常黏液質成熟劑顆粒可有效地改善APP/PS1轉基因小鼠的空間學習和記憶能力。病理觀察結果顯示，異常黏液質成熟劑顆?？筛纳平M織結構受損的腦神經細胞，減少細胞損傷，降低神經纖維纏結的程度和老年斑的形成，減輕神經元細胞的受損，減輕粗面內網和游離核糖體的損傷。提示異常黏液質成熟劑能改善APP/PS1轉基因小鼠腦內神經元線粒體、突觸的結構損傷。

參考文獻：

[1] 新疆維吾爾自治區衛生廳中國醫學百科全書維吾爾醫分卷辦公室. 中國醫學百科全書：維吾爾醫學分卷[M].烏魯木齊：新疆人民衛生出版社，1985：17-25.

[2] MORRIS R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J]. J Neurosci Methods，1984，11（1）：47-60.

[3] 帕麗丹·吾術爾，買吾拉尼江·依孜布拉，努爾買買提·艾買提，等.阿爾茨海默病異常黑膽質病證結合大鼠模型血清代謝組學研究[J].科技導報，2014，32（28/29）：39-47.

[4] 邱昕，陳國華，馮佩，等.黃連解毒湯對APP/PS1雙轉基因AD小鼠海馬區病理形態學及腦內tB-APP基因表達的影響[J].神經損傷與功能重建， 2010，5（6）：404-408.

[5] 哈木拉提·吾甫爾，黨明，熱娜古麗·艾則孜，等.異黑顆粒對APP/PS1雙轉基因模型小鼠學習記憶和抗氧化能力的影響[J].科技導報，2013， 31（14）：26-29.

[6] OANA C， Lucian H， Marius M， et al. Cognitive-enhancing and antioxidant activities of inhaled coriander volatile oil in amyloid β（1–42） rat model of Alzheimer's disease[J]. Physiology & Behavior，2013，120（15）：193-202.