HPLC-ELSD法同時測定桔梗中5種皂苷含量

岳　虹，陳芙蓉，王夢麗，謝紅英，馮亞男，徐小平

（四川大學華西藥學院，四川成都610041）

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HPLC-ELSD法同時測定桔梗中5種皂苷含量

岳虹，陳芙蓉，王夢麗，謝紅英，馮亞男，徐小平

（四川大學華西藥學院，四川成都610041）

摘要：建立高效液相色譜法同時測定桔梗藥材中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的方法。色譜柱為ODS 250 mm×4.6 mm×5μm，流動相A為乙腈-0.2%甲酸，流動相B為水，采用梯度洗脫（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。供試品經50%甲醇（ν/ν）超聲提取30min，過濾蒸干后以50%甲醇（ν/ν）定容至5mL容量瓶中；漂移管溫度為75℃，氮氣流量為2.5L/min。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D分別在0.64～6.4μg、1.22～12.2μg、1.08～10.8μg、0.74～7.4μg，1.7～17μg范圍內組分濃度與峰面積線性關系良好；藥材中5種成分的平均加標回收率分別為101.1%、99.9%、100.4%、100.7%和101.6%；RSD均＜5%。該方法簡便、準確，分離效果好，可用于桔梗藥材的質量控制。關鍵詞：桔梗；桔梗皂苷；HPLC-ELSD；梯度洗脫

0　引言

桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）為桔梗科（Campanulacae）桔梗屬（Platycodin）多年生草本植物[1]，廣泛分布于東亞地區，我國多地區均有種植。桔梗的主要活性成分是齊墩果烷型三萜皂苷，藥理研究表明桔梗皂苷具有多種活性，包括抗癌、抗氧化、抗丙肝、減肥等功能[2-3]，而對桔梗藥材質量的有效控制是其發揮藥效的基礎。

我國幅員遼闊，桔梗藥材生長環境差異大，導致其質量良莠不齊，有效成分含量變化大，有必要加強其質量控制以保證藥效[4-5]。桔梗中皂苷成分結構復雜，活性多樣，而在《中國藥典》2010版中僅對桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）設定了含量限度[6]，不能更全面地反映藥效和控制桔梗藥材質量。本文通過對不同產地桔梗中去芹糖桔梗皂苷E（deapioplatycoside E）、桔梗皂苷E（platycoside E）、桔梗皂苷D3（platycodin D3）、去芹糖桔梗皂苷D（deapioplatycodin D）及桔梗皂苷D（platycodin D）5種桔梗皂苷成分進行測定，建立了桔梗皂苷HPLC-ELSD含量測定方法，為桔梗藥材質量控制提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-100高效液相色譜儀（上海伍豐儀器公司）；ELSD-UM 5000蒸發光散射檢測器（上海通微分析技術有限公司）；N2000數據采集軟件（浙江大學）；MS105DU電子天平（瑞士梅特勒托利多儀器公司）；LEO-801超聲清洗器（昆山超聲設備有限公司）。

1.2試藥與樣品

桔梗藥材樣品分別購自山東、安徽、甘肅、四川、及河北等桔梗產區（見表7），均為桔梗科植物桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）的根。桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3對照品均為實驗室自制，經HPLC面積歸一化法測定純度高于98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱Promasil C18（250mm×4.6mm×5μm），柱溫30℃；流動相A為乙腈-0.2%甲酸，流動相B為水，梯度洗脫（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。流量1.0mL/min；進樣量20 μL；ELSD檢測器檢測參數：漂移管溫度75℃，載氣（N2）流量2.5 L/min。色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取對照品去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D適量，加50%甲醇制成每1mL分別含有去芹糖桔梗皂苷E 0.32mg、桔梗皂苷E 0.61mg、桔梗皂苷D30.54mg、去芹糖桔梗皂苷D 0.37mg、桔梗皂苷D 0.85 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

取桔梗樣品2.0g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定質量，超聲處理30min，取出，常溫冷卻，再稱定質量，用50%甲醇補足損失質量，搖勻，過濾，精密量取續濾液25mL，在60℃下減壓蒸干，殘渣加少量50%甲醇轉移至5mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖1　桔梗藥材和5種皂苷對照品的HPLC-ELSD譜圖

2.4供試品溶液的制備方法優化

2.4.1提取溶劑的考察

取桔梗藥材粉末（批號20130615，產地安徽亳州）（過5#號篩）3份，各2.0g，精密稱定，分別精密加入甲醇、50%甲醇和水50mL，每份稱3個平行樣，按照2.3供試品的制備方法進行制備，測定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結果顯示，50%甲醇提取的5種桔梗皂苷含量高于甲醇和水，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.4.2提取方式的考察

取桔梗藥材粉末（批號20130615，產地安徽亳州）（過5#號篩）4份，各2.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50mL，稱定質量，分別超聲處理15min、30min、1h，回流提取2 h，按照2.3供試品的制備方法進行制備，測定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結果見表1。由表可知，在超聲30min后，5種桔梗皂苷已基本提取完全，且超聲30min與回流2h效果相當。為操作簡便，采用超聲30min作為提取方式。

表1　不同提取方式對桔梗皂苷提取的影響

2.4.3料液比的考察

取桔梗藥材粉末（批號20130615，產地安徽亳州）（過5#號篩）4份，各2.0 g，精密稱定，分別加入50%甲醇30，40，50，60mL，稱定質量，超聲30min后，按照2.3供試品的制備方法進行制備，測定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，如表2所示。結果表明在其他提取條件一致的情況下，料液比為1：25時桔梗皂苷提取較為徹底，因此選擇提取料液比為1：25。

表2　不同提取料液比的考察

2.4.4提取次數的考察

取桔梗藥材粉末（批號20130615，產地安徽亳州）（過5#號篩）3份，各2.0 g，精密稱定，分別加入50%甲醇50 mL，稱定質量，對3份供試品分別提取1，2，3次，分別合并2次和3次提取液，按照供試品的制備方法測定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結果顯示在其他提取條件一致的情況下，提取1次已經基本將供試品中5種皂苷成分提取出，因此選擇提取次數為1次。

2.5線性范圍考察

精密吸取2.2項下對照品混合溶液2，4，8，12，16，20μL，分別注入液相色譜儀進行測定，以峰面積的自然對數（y）對進樣量的自然對數（x）進行線性回歸，得回歸方程，結果見表3，表明各成分在相應范圍內，進樣量與峰面積呈現良好的線性關系。

表3　桔梗皂苷的線性關系考察

2.6進樣精密度

精密吸取混合對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，測定各成分峰面積的自然對數值并計算RSD。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分別為1.2%，2.3%，2.8%，3.4%，0.9%，結果表明儀器的精密度良好。

2.7穩定性試驗

取同一對照品溶液，分別于0，4，10，24，28，30h注入液相色譜儀，測定各成分峰面積的自然對數值并計算RSD值。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分別為1.8%，1.3%，2.1%，1.4%，1.9%，結果表明對照品溶液在30h穩定性良好。

2.8重復性試驗

取同一批次桔梗藥材（批號20130615，產地安徽亳州），平行制備6份供試品溶液，按照2.3供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按照上述色譜條件進行HPLC分析。根據所測峰面積的自然對數計算各成分在樣品中的含量。結果表明去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的平均含量分別為0.06%，0.23%，0.21%，0.08%，0.31%，RSD分別為1.2%，2.2%，1.6%，1.0%，1.8%，該方法重復性較好。

2.9加標回收率試驗

表4　桔梗皂苷平均加標回收試驗（n=6）

取已知含量的桔梗藥材粉末適量，精密稱定，置具塞三角瓶中，分別精密加入去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D對照品適量，按照2.3供試品制備方法操作，制備6份加標供試品溶液。吸取加標供試品溶液20μL注入液相色譜儀，測定各成分平均含量。根據測得量和加入量，計算各待測成分的回收率，結果見表4。

2.10樣品測定

取不同產地的桔梗藥材，按照2.3供試品制備方法制備供試品溶液，測定樣品中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，平行測定3次，結果如表5所示。

表5　不同產地桔梗藥材的測定結果（n=3）%

3　討論

桔梗的主要成分是三萜皂苷，這一類型化合物結構缺乏強紫外吸收的生色團，僅在苷元C12-C13位置上具有單一雙鍵，使其在210nm附近具有紫外吸收，該波長范圍為溶劑末端吸收區，易產生溶劑干擾和基線的不穩定，從而對樣品的測定產生干擾，造成測定結果不準確。而采用蒸發光散射檢測器則因成分對激光光源發生散射產生信號進行測定，避免了紫外吸收干擾，從而適用于皂苷類弱紫外吸收成分的測定[7-9]。

在《中國藥典》2010年版中有關桔梗含量測定項下采用的色譜條件是25%乙腈等度洗脫，但在色譜條件下需要對樣品進行復雜的前處理才能取得較為理想的分離度。為此，本試驗采用梯度洗脫的方式可更有效地同時分離混合樣品中的各個組份，同時簡化了樣品前處理步驟，縮短了分析時間，提高工作效率。

通過對不同產地10批次的桔梗藥材進行含量測定，結果表明去芹糖桔梗皂苷D和桔梗皂苷D是桔梗藥材中的主要皂苷成分，且這兩種成分在不同產地的桔梗藥材中的含量都較為穩定。另外，有研究表明去芹糖桔梗皂苷D具有多種藥理活性[10-12]。因此，除藥典原有的桔梗皂苷D以外，提示去芹糖桔梗皂苷D可成為桔梗藥材質量標準的待選指標，以便提高藥材的質量控制標準。

4　結束語

本方法操作簡便，定量準確，實現同時測定桔梗藥材中5種桔梗皂苷的含量，可應用于桔梗藥材的質量控制。

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（編輯：徐柳）

Simultaneous determination of the content of 5 Platycosides in Platycodon radix

YUE Hong，CHEN Furong，WANG Mengli，XIE Hongying，FENG Ya’nan，XU Xiaoping
（West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Abstract:Simultaneously determination of the 5 platycosides in Platycodon radix with HPLC-ELSD method. Gradient elution（0-15min，20%-22%A；15-60 min，22%A；60-65 min，22%-30%A；65-70 min，30%-20%A）is carried out under the following conditions: ODS 250 silica gel as solid phase（250mm×4.6mm×5μm），acetonitrile -0.2% methanoic acid as mobile phase A，and water as mobile phase B；the test products are ultrasonically extracted with 50% methanol（ν/ν）for 30 min，filtered and dried by distillation before further dilution with 50% methanol（ν/ν）to a 5mL volumetric flask；and the drift tube is set at 75℃and the nitrogen flow rate 2.5 L/min. The compositionconcentrationshows agoodlinear relationshipwiththepeakareawhen deapioplatycoside E，platycoside E，platycodin D3，deapioplatycodin D and platycodin D are 0.64-6.4 μg，1.22-12.2 μg，1.08-10.8 μg，0.74-7.4 μg and 1.7-17 μg respectively. The average recoveries of the five ingredients are 101.1%，99.9%，100.4%，100.7% and 101.6% respectively. All the RSDs are lower than 5%. The method is simple，accurate and efficient，suitable for the quality control of Platycodonradix.

Keywords:Platycodon radix；Platycoside；HPLC-ELSD；gradient elution

通訊作者：徐小平（1962-），男，四川宜賓市人，副教授，碩士，主要從事藥品質量控制研究。

作者簡介：岳虹（1981-），女，四川成都市人，碩士研究生，專業方向為藥物分析。

收稿日期：2015-07-12；收到修改稿日期：2015-09-10

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.01.012

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2016）01-0049-04