溫州地區原發性肝細胞癌TP53基因249密碼子突變研究

胡偉建，鄭亦胡，鮑海力，朱椰凡，張啟瑜(溫州醫科大學附屬第一醫院肝膽外科，浙江溫州325000)

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溫州地區原發性肝細胞癌TP53基因249密碼子突變研究

胡偉建，鄭亦胡，鮑海力，朱椰凡，張啟瑜
(溫州醫科大學附屬第一醫院肝膽外科，浙江溫州325000)

[摘 要]目的 檢測溫州地區原發性肝細胞癌的TP53基因249密碼子突變情況，并探討其在肝細胞癌中所起的作用及其臨床意義。方法 收集石蠟包埋的原發性肝細胞癌組織120例，應用Sanger測序技術檢測突變情況。運用Spearman檢驗分析腫瘤組織中TP53基因249密碼子突變與原發性肝細胞癌患者臨床病理特征之間的相關性。結果 TP53基因249密碼子在120例肝癌組織中總突變率為3.33%(4/120)，進一步分析顯示TP53基因249密碼子突變與肝細胞癌患者的臨床病理因素未發現存在相關性(P＞0.05)。結論 在溫州地區，TP53基因249密碼子突變為非高發事件，未發現其與原發性肝細胞癌的進展相關。

[關鍵詞]TP53；249密碼子；癌，肝細胞

Analysis of mutation of TP53 gene codon 249 in primary hepatocellular carcinoma in Wenzhou area HU Wei-jian, ZHENG Yi-hu, BAO Hai-li, ZHU Ye-fan, ZHANG Qi-yu.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Af■liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China

Abstract ObjectiveTo investigate the mutation of TP53 gene codon 249 in primary hepatocellular carcinoma (HCC) in Wenzhou area, and explore its role in the development of HCC.Methods A total of 120 paraf■nembedded primary HCC tissues were collected, the Sanger sequencing technique were used to detect the mutation.The Spearman test was applied to analysis the correlation of the mutation of TP53 gene codon 249 and the clinicopathological features in HCC patients.ResultsMutation of codon 249 was found in 4 cases with a mutation rate of 3.33% (4/120)； the research also showed that the mutation of codon 249 had no correlation with the clinicopathological feature in HCC patients (P＞0.05).ConclusionOur data suggests that the incidence of mutation of p53 gene codon 249 in Wenzhou area is low and little contribution to the development of the hepatocelluar carinoma.

Key words TP53； 249 codon； heaptocellular carcinoma

原發性肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病機制是一個多因素、多步驟的復雜過程[1]。Bressac 等[2]發現肝癌中TP53存在基因的結構和表達異常，該基因發生突變后，抑癌功能喪失。后續研究報道[3-4]，肝癌TP53基因存在多個位點基因錯義突變，其第七外顯子249位密碼子突變為為肝細胞肝癌所特有，在發病中起重要作用[5]。進一步研究[6-7]發現TP53基因249編碼子突變與黃曲霉素暴露密切相關。溫州市疾控中心腫瘤死因調查資料[8]顯示，溫州地區每10萬人中就有51人死于肝癌，而炎熱、潮濕的氣候，為該地區黃曲霉素的污染創造了有利條件。目前，該地區TP53基因249密碼子突變的資料還比較少，故本文研究該地區原發性肝細胞癌患者TP53基因249密碼子突變的情況，探討TP53基因249密碼子突變在肝癌發病機制中所占的地位及其與肝癌臨床病理特征的關系。

1　材料和方法

1.1材料來源

石蠟包埋標本取自我院2007年1月到2009年7月手術切除的120例肝細胞癌患者。其中男108例，女12例；所有組織標本均由我院病理科做出病理診斷，均為原發性肝細胞癌，其中低分化34例，中分化66例和高分化20例。手術標本經10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，于40 ℃溫水中撈片，然后放在60 ℃烤箱中烘烤1 h，充分烤干。本研究經溫州醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器

Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、DNA提取試劑盒均來源于上海生物工程有限公司。測序儀為美國ABI公司3730XL。

1.3實驗方法

1.3.1 DNA提取:石蠟標本經二甲苯和乙醇脫蠟后，按照DNA抽提試劑盒說明書提取DNA，2%瓊脂糖電泳檢驗抽提DNA完整性，并用紫外分光光度法檢測濃度及純度，確保樣本DNA的OD值為1.8～2.0之間。

1.3.2 PCR反應:擴增TP53基因第七外顯子的引物由上海生工公司合成，引物序列為:引物F:5＇-CCCAGG GGTCAGAGGCAA-3＇；引物R:5＇-GGGCGACAGAGCGAGAT TC-3＇。取DNA模板1 μL，依次加入引物F 1 μL、引物R 1 μL、dNTP(10 mM)1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、PCR緩沖液5 μL、MgCl2(25 mmol/L)5 μL、雙蒸水35.5 μL，共50 μL反應體系。95 ℃變性3 min后，94 ℃熱變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環后72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖電泳見擴增出290 bp的基因片段即為所需片段，見圖1。

圖1　擴增的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

1.3.3 TP53突變分析:采用HaeIII限制性內切酶分析TP53基因249密碼子突變，酶切反應體系為5 μL PCR產物、10 μL HaeIII、1 μL 10倍緩沖液，3.4 μL雙蒸水。酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，出現290 bp條帶著為TP53基因249密碼子突變。

1.3.4 突變測序:將30 ng PCR擴增產物作為模板，依次加入3.2 pmol引物和6 μL Big Dye Termintor，用MilliQ水補足至20 μL，用ABI 3730XL自動測序儀測序。

1.4統計學分析

采用SPSS 16統計分析軟件。TP53基因249密碼子突變與患者臨床病理特征之間的關系采用Spearman檢驗進行相關性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1TP53基因249密碼子突變情況

120例的標本中，116例(96.67%)為AGG，3例(2.5%)為AGT，1例(0.83%)為AGC，總突變率為3.33%，見圖2。

圖2　TP53基因249密碼子突變情況

2.2肝細胞癌患者的地區分布情況

鹿城區40例；甌海區16例；龍灣區7例；永嘉縣18例；蒼南縣9例；洞頭縣4例；平陽縣5例；泰順縣1例；文成縣5例；瑞安市7例；樂清市8例。具體分布見圖3。

圖3　120例肝細胞癌患者的地區分布圖

2.3TP53基因249密碼子突變與臨床病理特征之間關系

Spearman相關性檢驗未發現TP53基因249密碼子突變與各臨床病理特征存在相關性。具體見表1。

表1　TP53基因249密碼子突變與臨床病理特征相關性分析

3　討論

TP53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因之一，野生型TP53基因為抑癌基因，可以誘導細胞生長阻滯，細胞凋亡，細胞分化以及受損的細胞進行修復，避免細胞進一步向惡變進展[9]。正常TP53基因編碼p53蛋白，具有抑制腫瘤發生、發展的功能。p53蛋白的一些結構域是高度保守的，這些結構域和第五至七外顯子是經常發生突變的位置，如果發生點突變則編碼的多肽就會影響p53蛋白的空間結構構象的正確形成，也會影響p53蛋白抑制細胞周期的功能，從而導致細胞增殖的失控，引起癌變[10]。

第七外顯子249密碼子突變是TP53基因最常見的突變。1991年，Hsu等[3]在研究我國啟東地區肝癌發病過程中，發現16例肝癌中有8例存在TP53基因點突變，且均位于第249密碼子第三堿基，Bressac 等[4]在研究南非地區肝癌過程中，也發現50%(5/10)TP53基因這一點突變。249密碼子突變主要發生G→T顛換，這一顛換使249密碼子編碼的蛋白由精氨酸變成絲氨酸，引起p53蛋白結構發生改變，從而影響p53蛋白功能[3]。為進一步驗證249密碼子突變與肝癌關系，吳智群等[11]在小鼠中引入TP53基因249密碼子點突變，該突變減弱p53在細胞周期阻滯和凋亡中的作用，對TP53的抑癌功能產生影響，在肝癌的發病中起著非常重要的作用。

在調查江蘇的啟東地區和廣西扶綏地區肝癌發病情況時發現，肝癌發生不僅與乙肝感染相關，而且與黃曲霉素暴露相關[12]，黃曲霉素等環境致癌物暴露HBV感染是TP53基因249密碼子突變的主要原因。體外研究也同樣證明黃曲霉素暴露能夠導致249密碼子第三堿基G→T顛換[13]。這種突變使p53失去促凋亡活性而部分獲得促進細胞周期G0/G1期轉變的功能[14]。249密碼子突變程度在一定程度上能夠反映該地區黃曲霉素暴露程度。在上海地區52例肝癌患者中有10例發生突變。在臺灣地區肝癌研究中發現38例肝癌患者中有3例發生249密碼子突變，在日本279例肝癌患者中有41例發生突變[15]，根據249密碼子突變發生率分級[16]，這些地區屬于黃曲霉素中等暴露地區。在經濟發達地區，黃曲霉素暴露仍然不可忽視。

在本研究中，共收集了本院溫州地區120例肝癌患者標本，回顧性研究并分析TP53基因249密碼子突變情況，以及其在肝癌發生發展過程中的作用。本研究使用Sanger測序技術對120例肝細胞肝癌組織進行TP53基因249密碼子進行檢測，發現TP53基因249密碼子總突變率為僅為3.33%，突變發生率遠低于啟東等地區，但與意大利、法國等地區發生率相接近。對這些突變進行點突變檢測，其中有3例249密碼子由AGG變成AGT，1例變為AGC，與既往其他研究相符合。一般研究顯示，正常肝組織中在黃曲霉素暴露下TP53基因249密碼子極少發生突變，伍國俊[17]檢測了10例肝移植供肝及肝外傷切除組織，249密碼子均沒有發生突變。本研究中僅4例249密碼子發生突變，可考慮在溫州地區仍然存在黃曲霉素暴露，屬于低黃曲霉素暴露區，其249密碼子在肝癌的發生過程中產生突變。分析原因:隨著人們生活水平的提高，衛生環境的改善，食用黃曲霉毒素污染的食物的幾率下降。在本研究收集的120例患者中，63位患者來自溫州市區，衛生情況相對較好，相對于其他縣市的患者來說，黃曲霉素暴露的情況可能性小(圖3)。為進一步研究其與臨床病理特征之間關系，探究該突變在腫瘤進展過程是否發生作用，對腫瘤數目、大小、AFP、分化、門靜脈侵犯、TNM分期等指針行相關性檢驗。Spearman相關性檢驗與各臨床病理特征相關性分析P值均大于0.05，不能提示294密碼子突變與臨床病理改變相關，故認為294密碼子突變與腫瘤數目、大小、AFP、分化、門靜脈侵犯、TNM分期等臨床特征不相關。

在我們收集的病例中HBV感染患者占95%(114/ 120)，丙肝及其他因素導致經占少數，而4例突變患者具有乙肝感染病史。既往有研究表明黃曲霉素更容易使感染乙肝的患者發生249密碼子突變[18]，具體機制待進一步研究，本研究尚不足說明該突變與乙肝的關系。

因此，在溫州地區TP53基因249密碼子突變為非高發事件，提示溫州為黃曲霉素低暴露地區。雖然在溫州地區黃曲霉素參與肝癌的發病，但在肝癌的發生中不起主導作用，未發現其與肝癌進展相關。HBV感染是該地區誘發肝癌的主要因素，黃曲霉毒素污染誘發肝癌發病的患者僅占少數。

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(本文編輯:張和)

·論著 基礎研究·

[通訊作者簡介]張啟瑜，主任醫師，教授，博士生導師，E-mail:qiyuz@126.com。

作者簡介][第一胡偉建(1990-)，男，浙江縉云人，在讀碩士。

[基金項目]浙江省外科學重中之重學科資助項目(2008-255)。

[收稿日期]2015-06-30

[中圖分類號]R34； R735.7

[文獻標識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.010