葫蘆科蔬菜單倍體育種技術研究進展
——未授粉子房離體培養技術

黃金華，董彥琪，王文英，劉喜存，馬曉紅

（河南省新鄉市農業科學院 河南新鄉 453000）

未授粉子房/胚珠離體培養技術屬于離體雌核發育途徑（in vitro gynogenesis）[1-5]，是將未授粉子房/胚珠從母體上分離出來，在無菌的人工環境條件下誘導雌核發育，使其生長發育形成單倍體胚和植株的過程。利用該技術可快速獲得純系，縮短育種周期，加速育種進程。筆者側重綜述了該技術的一些重要影響因素，如基因型、胚囊發育時期、接種方式、植株生長環境、植物生長調節劑、碳源、硝酸銀、低溫預處理、熱激處理、倍性鑒定以及植株再生等，為該技術的開展和應用提供可行的理論依據。

1 基因型

基因型是影響未授粉子房胚胎發生的重要因素之一，選擇合適的基因型是植物未授粉子房離體培養成功的關鍵。Shalaby[2]對12種不同基因型西葫蘆品種的未授粉子房培養發現，‘Raad’F1材料表現最佳，胚誘導率為48.4%，每皿成苗15株。謝冰等[6-7]和劉栓桃等[8]研究也表明西葫蘆雌核離體培養存在明顯的基因型差異。劉栓桃等[8]對9個不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導培養發現，再生植株率最高的能達到33.33%，最低的僅為2.67%。杜勝利等[9]研究發現‘津春3號’的胚芽和愈傷組織誘導率均高于‘津雜2號’；陳小鵬等[10]也認為黃瓜基因型對雌核發育有著重要的影響。裴曉利等[11]研究表明，不同基因型黃瓜的未授粉子房對離體誘導培養的敏感度不同，9個品種單倍體誘導率變化幅度為65.52%～93.33%。Ficcadenti等[5]對2個甜瓜品種（‘Reticulatus’‘Inodorus’）及其雜交種進行了未授粉子房培養，結果顯示，‘Reticulatus’出胚率最高。韓麗華等[12]研究發現甜瓜不同的正反交組合對單倍體的誘導有顯著影響。

2 胚囊發育時期

胚囊發育時期對胚狀體的誘導至關重要。謝冰等[6-7]研究表明開花前1 d和開花當日西葫蘆胚珠誘導頻最高；劉栓桃等[8]對9個西葫蘆材料進行不同開花時期取材試驗，結果表明除1個材料沒能得到再生植株外，其他均表現為開花當天的胚珠最適合誘導培養，再生植株率最高；陳學軍等[13]研究表明處于成熟胚囊期即開花當天的西葫蘆未授粉子房的胚狀體誘導率、成苗率均最高。Gémesné等[14]發現黃瓜雌花開放前6 h胚囊剛好形成，胚誘導率最高。刁衛平等[15]發現，開花前1～4 d的黃瓜子房均可誘導獲得胚芽，但以開花前2～3 d的子房誘導率最高。Shalaby[2]對南瓜‘Giad’‘Raad’F1代的第一節雌花、第二節雌花和第三節雌花分別進行未授粉胚珠離體培養，發現第二節雌花胚誘導和成苗效果最佳。孫守如等[16]發現開花前1 d的南瓜胚珠已成熟或接近成熟，易于誘導。

3 接種方式

接種方式直接影響雌核發育的營養吸收，從而影響雌核發育的途徑。陳學軍等[13]比較4種接種方法對愈傷組織的影響，結果表明橫切分法接種的胚珠最先從切口處長出愈傷組織，且愈傷組織誘導率最高可達28%；其次為啄切、縱切而以完整胚珠法所得愈傷組織誘導率最低，為6%。究其原因可能是橫切、啄切和縱切給外植體以較大的創傷面而激發了愈傷組織的形成，也可能是創傷面增強了未授粉胚珠對養分的吸收能力。

4 生長環境

季節對未授粉子房離體培養的影響是顯著的，這可能與植物的生理生長特性有關。Przyborowski等[17]在黃瓜單倍體誘導中發現，春季材料的誘導率很低，僅是夏季材料誘導率的1/4。魏愛民等[18]研究表明黃瓜離體雌核發育的單倍體胚胎發生率和植株再生率在溫度相對較高的6月下旬、7月上旬以及9月份明顯高于其他季節；生長發育前期的供體植株單倍體再生率相對較高且穩定；隨著供體植株逐漸衰老，其未授粉子房培養的污染率不斷上升；種植于塑料大棚內的供體材料比種植在露地中的供體材料具有更高的單倍體胚胎發生率和成苗率。盛慧[19]試驗結果表明，秋季生長的黃瓜材料誘導率要高于春季，且不易污染，冬季的誘導效果一般。

此外，謝冰等[7]證實不同播期的西葫蘆材料胚狀體發生率存在極顯著差異，秋播材料的誘導率最高，夏播與春播都很低；孫守如等[16]在南瓜上也發現胚狀體發生和小苗的誘導集中在7月中旬和8月中旬。

5 培養基

5.1 基本培養基

黃瓜未授粉子房的離體培養一般采用MS培養基或是在MS培養基的基礎上對某些成分作一些調整[14]，也有使用專門針對黃瓜離體雌核誘導的CBM作為基本培養基的[9]。謝冰[6-7]和陳學軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養中分別采用的是N6培養基和MS培養基。謝冰等[7]研究認為培養基對西葫蘆胚狀體誘導率影響較大，篩選的M3、M2培養基有較高的利用價值。厚皮甜瓜的離體雌核誘導也是在MS培養基上誘導胚狀體發育成苗的[12]。

5.2 激素

激素對胚發生有著重要作用。Metwally等[4]在誘導西葫蘆未授粉胚胎分化時分別使用質量濃度為 0.1、1.0、5.0、10.0 mg·L-1的 2，4-D，結果發現 1.0和5.0mg·L-12，4-D處理的胚誘導率較高。謝冰等[7]篩選出2組適合西葫蘆胚狀體誘導的培養基，分別是N6+2.00 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA 和 N6+4.00 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-16-BA。陳學軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠培養過程中用 MS+1.00 mg·L-12，4-D+0.50 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA誘導出愈傷組織。

陳小鵬等[10]在黃瓜未授粉子房的胚狀體誘導試驗中發現，TDZ明顯促進胚狀體的生長和膨大，質量濃度為0.06和0.08 mg·L-1時胚狀體誘導率（分別為66.7%和64.9%）都極顯著高于其他處理，并且兩者之間沒有顯著差異。Diao等[20]認為，TDZ能促進黃瓜胚胎形成，以0.04 mg·L-1效果最佳。Malik等[21]研究發現，誘導培養基中添加0.04和0.02 mg·L-1的TDZ能有效促進甜瓜未授粉子房胚珠愈傷產生，胚誘導率分別為46.60%和65.83%，而質量濃度為0.60 mg·L-1的6-BA激素可顯著提高外植體再生率。

此外，Kwack等[22]研究認為，植物激素對南瓜的胚發生有著重要作用。韓麗華等[12]用細胞分裂素Zip、BA和IBA成功地誘導出厚皮甜瓜的胚狀體植株。

5.3 碳源

一般采用蔗糖作為碳源。謝冰等[6]關于西葫蘆離體雌核培養誘導胚狀體的試驗表明，30 g·L-1蔗糖對胚狀體的發生是有利的，誘導率較高。陳小鵬等[10]試驗表明蔗糖質量濃度為40 g·L-1時黃瓜胚狀體誘導效果最好。Shalaby[2]在西葫蘆品種‘Eskan?drani’胚珠誘導時使用 30、60、90 g·L-1的蔗糖質量濃度梯度比較發現，30 g·L-1時胚珠誘導效率最佳，而90 g·L-1時胚珠完全不能生長。這些結果表明，在愈傷組織芽分化時可能需要較低的滲透壓。韓麗華等[12]研究表明甜瓜胚狀體誘導適宜蔗糖質量濃度為 30 g·L-1。

5.4 AgNO3

AgNO3是乙烯合成的抑制劑。Mohiuddin等[23]認為AgNO3影響愈傷組織的內源激素代謝從而有利于瓜類作物植株的再生。韓麗華等[12]研究表明AgNO3有利于甜瓜胚狀體的誘導，當質量濃度為 80 mg·L-1時出胚率最高，為0.74%。這可能是由于NO3-影響了離體培養過程中的某種激素的代謝，從而間接影響了胚狀體的形成與生長。而Diao等[20]研究發現AgNO3對胚誘導并沒有顯著影響，但會縮短胚胎萌芽期和提高胚胎形成數目，且選用的材料之間出胚率并無顯著差異。

6 處理方式

6.1 低溫預處理

低溫預處理極有可能改變雌核發育途徑，從而導致單倍體胚形成。Kwack等[22]研究表明，南瓜在5℃條件下預處理2d能提高胚胎的發生率。Shalaby[2]研究表明西葫蘆品種‘Queen’F1在4℃預處理4 d時效果最佳。Metwally等[4]將開花前1 d的西葫蘆品種‘Eskandarani’在4℃條件下分別進行0、2、4、8d 預處理，結果發現不進行預處理的的材料具有最高的胚誘導率。

6.2 熱激處理

Gémesné等[14]對黃瓜離體雌核進行熱激處理，結果表明，在誘導培養時35℃熱激處理2～4 d獲得的胚狀體誘導率和植株再生誘導率最高。Diao等[20]進一步對黃瓜熱激處理，在35℃條件下熱激3 d的效果較2 d和4 d的好。陳小鵬等[10]認為35℃熱激處理是黃瓜未授粉子房胚狀體誘導的最佳預處理溫度。Shalaby[2]研究表明西葫蘆品種‘Queen’F1在32℃熱激處理4 d時效果最佳。

7 倍性鑒定與植株再生

7.1 倍性鑒定

瓜類二倍體植株與單倍體、三倍體、四倍體在形態上有比較明顯的差別[24]，主要表現在子葉、真葉、花的形狀和顏色，果實形狀以及種子的形態。這些形態差異是從外觀上用目測法鑒別瓜類多倍體較為可靠的指標。謝冰等[6]用西葫蘆未授粉胚珠誘導出120株再生植株，其中42株性狀表現符合二倍體植株（2n=2x=40）特征且育性正常，并獲得自交果實及種子。

對獲得的植株細胞染色體計數是最有效的方法，但染色體制片需要較高的細胞學水平，且費時、費力。Metwally等[4]對由西葫蘆未授粉子房離體誘導的20株再生植株的根尖染色體進行觀察，結果表明，有5株單倍體植株（2n=x=20）、15株二倍體植株（2n=2x=40）。Diao等[20]對40株再生黃瓜植株的卷須染色體染色進行觀察，結果表明，有2株單倍體植株（2n=x=7）、33株二倍體植株（2n=x=14）、5株四倍體植株（2n=4x=28）。

葉綠體數目隨染色體倍數的升高而增加，因而可采用氣孔保衛細胞葉綠體計數法來間接鑒別再生植株的倍性。劉栓桃等[8]將西葫蘆未授粉胚珠誘導的20株再生植株經氣孔保衛細胞葉綠體計數法鑒定，結果為8株單倍體植株，12株二倍體植株。

7.2 植株再生

謝冰等[6]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養中，以20 g·L-1蔗糖或葡萄糖作碳源的無激素N6植株再生培養基上培養出健全胚狀體的成苗。劉栓桃等[8]對4個西葫蘆品種未授粉子房培養，在質量濃度為0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D 的培養基上再生植株產率最高，達28.33%。陳學軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養中，誘導的愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA+2.0%蔗糖+0.8%瓊脂培養基上芽誘導率最高，為15.6%；高濃度的NO3-有利于不定芽根的形成，但其作用機制尚不清楚。孫守如等[16]研究發現觀賞南瓜未授粉胚珠誘導胚狀體的效果以 MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+30.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂處理較好，分化、再生培養基分別以MS+30.0g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂、MS+30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂+1.0 g·L-1活性炭效果最佳，其胚狀體發育成正常植株率達70%以上。

8 問題與展望

利用未授粉子房培養技術獲得瓜類單倍體植株是一個較為成功的途徑，眾多國內外學者研究了一些影響因素，如基因型、胚囊發育時期、接種方式、植株生長環境、植物生長調節劑、碳源、硝酸銀、低溫預處理、熱激處理、倍性鑒定以及植株再生等，并取得了一些重要進展，如2，4-D與NAA、6-BA配合使用雖然對胚狀體的誘導率有利，但畸形胚狀體的比例較高，主要在誘導過程中出現畸形胚狀體或健全胚狀體轉接后表現出發育異常；誘導溫度高于35℃時接種組織的褐化和玻璃化情況較嚴重，生長培養基中加入0.05 mg·L-1抗壞血酸針劑可有效防止胚狀體再生長過程中的氧化；未授粉胚珠的取樣部位對胚狀體的形態建成及后續的成苗有顯著影響，子房中部的胚珠發育充分有利于誘導出健全胚狀體；葉片保衛細胞葉綠體計數鑒定法與再生植株自交后代田間性狀整齊度觀察相結合，不僅可鑒定再生植株的起源和倍性，而且還可對再生植株的農藝性狀進行調查研究。

未授粉子房培養技術已在黃瓜、西葫蘆、甜瓜、南瓜等瓜類作物取得了單倍體胚和單倍體植株，該技術為研究離體雌核發育機制、開展更廣泛的未授粉胚珠（雙）單倍體培養方法奠定了基礎。離體培養能夠引起各種類型的突變，影響培養物的遺傳穩定性，這已是不爭的結論。瓜類離體雌核發育胚狀體的形成及成苗過程涉及的影響因素更為復雜，如需全面地了解再生植株成苗的機制，尚需進行更加深入的研究。