黃芪甲苷對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化和結締組織生長因子表達的影響

蔣洪強，張金國，譚洪勇，尉希清

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黃芪甲苷對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化和結締組織生長因子表達的影響

蔣洪強，張金國，譚洪勇，尉希清

摘要

關鍵詞黃芪甲苷；心力衰竭；結締組織生長因子；心肌纖維化

作者單位：250100 山東省濟南市，山東大學醫(yī)學院 內科學（蔣洪強 ）；濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院 心內二科（張金國、譚洪勇、尉希清）

Effects of Astragaloside IV on Myocardial Fibrosis and Connective Tissue Growth Factor Expression in Experimental Rats With Chronic Heart Failure

JIANG Hong-qiang, ZHANG Jin-guo, TAN Hong-yong, WEI Xi-qing.
Department of Medicine, Shandong University Medical College, Jinan (250100), Shandong, China
Corresponding Author: ZHANG Jin-guo, Email: cck112000@aliyun.com

Abstract

Objective: To observe the effects of astragaloside IV on myocardial fibrosis and connective tissue growth factor (CTGF) expression in experimental rats with chronic heart failure (CHF).

Methods: CHF model was established by abdominal aorta constriction (AAC) and the rats were divided into 5 groups: Sham operation group, the rats received normal saline 2 ml/day, n=10, CHF group, the rats received normal saline 2 ml/day, n=12; Astragaloside IV groups, CHF rats received astragaloside IV at (20, 40, 60) mg/kg respectively and n=12 in each group.All animals were treated for 4 weeks.Hemodynamic indexes were monitored, left ventricular mass index (LVMI) was calculated, morphologic changes of myocardial tissue was observed by HE staining, myocardial fibrosis degree and collagen volume fraction (CVF) were measured by Masson staining.The mRNA and protein expressions of CTGF were detected by RT-PCR and immunohistochemistry, Western-blot analysis respectivety.

Results: Compared with CHF group, 3 Astragaloside IV groups had decreased LVMI and CVF, P<0.05-0.01; Astragaloside IV (40 and 60) mg/kg groups presented decreased LVEDP and LVSP, increased ±dp/dtmax, P<0.01 to P<0.05 and improved pathologicalmorphology.Compared with Sham group, CHF group had increased average CTGF OD value (0.09 ± 0.03) vs (0.45 ± 0.04) and increased expression of myocardial CTGF (0.57 ± 0.06); compared with CHF group, the average CTGF OD values in Astragaloside IV (20, 40, 60) mg/kg groups were all decreased (0.39 ± 0.05), (0.30 ± 0.06), (0.24 ± 0.04) and decreased expressions of myocardial CTGF (0.44 ± 0.05), (0.35 ± 0.02), (0.28 ± 0.03) respectively, all P<0.01.

Conclusion: Astragaloside IV can inhibit myocardial fibrosis and improve cardiac function in CHF rats, which might be via inhibiting the over expression of myocardial CTGF.

Key words Astragaloside IV; Heart failure; Connective tissue growth factor; Myocardial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:165.)

慢性心力衰竭（CHF）是各種器質性心臟疾患的最終歸宿，5年的存活率和惡性腫瘤相似[1]。在中國34～74歲之間的年齡段的人群，就有超過400萬的心力衰竭（心衰）患者，年死亡率更是高達40%，同時心衰的患者數(shù)量不斷增加，年增長率已達2.8%[2]。心肌纖維化是慢性心衰的重要特征，而結締組織生長因子（CTGF）是最近幾年發(fā)現(xiàn)與心肌纖維化密切相關的細胞因子[3]。黃芪甲苷是中藥黃芪制劑中的主要活性成分，其含量是黃芪制劑的質量控制標準。黃芪甲苷具有抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化等多效性的作用[4]，本研究應用黃芪甲苷干預CHF大鼠模型，觀察其對心肌纖維化、心室重構等影響，進一步探討黃芪甲苷的CHF保護作用是否通過抑制CTGF的表達有關。

1　材料與方法

材料及儀器：SD雄性大鼠100只（山東魯抗醫(yī)藥提供，生產(chǎn)許可證號：scxk魯20130001），體重280～300 g；10 %水合氯醛；青霉素（80萬U/支，山東魯抗醫(yī)藥提供）。BL-420生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟公司）,ChemiDocMP成像分析系統(tǒng)。黃芪甲苷（純度＞98%，南京青澤醫(yī)藥公司），兔抗鼠多克隆抗體CTGF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（USA，Proteintech），Masson染色、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、免疫組化（SP）試劑盒（北京中杉金橋公司）,鹽酸緩沖液PBS（NaCl，KCl，Na2HPO4，K2HPO4，pH7.4），TBSP緩沖液（Tris-HCl，Nacl，Tween20，pH7.4）。

腹主動脈縮窄術致CHF大鼠模型的建立：100只大鼠按照參考文獻[5]操作建立模型，其中有10只大鼠僅穿線而不結扎腹主動脈，術后連續(xù)3 d給予腹腔注射青霉素（20萬U/只），常規(guī)喂養(yǎng)8周。術后第8周90只行腹主動脈縮窄術的大鼠存活53只（58.9%），隨機抽取5只大鼠行血液動力學監(jiān)測，左心室舒張末期壓力（LVEDP）均大于15 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）,提示CHF模型成功建立。

實驗分組：假手術組：僅穿線而不結扎腹主動脈大鼠（n=10）, 每日給予2ml生理鹽水；48只CHF模型大鼠平均分為4組（n=12），即（1）模型組:每日給予2 ml生理鹽水；（2）黃芪甲苷不同濃度3個組：每天給予2 ml不同劑量黃芪甲苷溶液（低劑量組20 mg/kg；中劑量組40 mg/kg；高劑量組60 mg/kg）。連續(xù)給藥4周。

心臟血液動力學指標檢測：給藥第4周后，5組大鼠按照實驗操作進行血流動力學檢測，記錄并分析LVEDP、左心室內壓最大變化速率（±dp/dt max）、左心室收縮壓（LVSP）等指標。

心臟組織采集：待血液動力學指標測量完成后取出心臟，計算左心室質量/體重（LVW/BW，即LVMI）、心臟質量/體重（HW/BW）,同時取大約0.5 cm厚的左心室組織置于4%多聚甲醛中用來包埋、切片（4 μm），以備蘇木素伊紅（HE）、Masson以及免疫組化染色，剩余組織用于蛋白免疫印跡（Western-blot）實驗。

心肌膠原容積分數(shù)（CVF）的測定：按照Masson染色試劑盒的說明進行操作，在光學顯微鏡下進行觀察，每只大鼠取4個不含血管的視野進行IPP6.0圖像分析系統(tǒng)處理，計算膠原組織所占面積的百分比，取平均值作為每只大鼠的CVF。

RT-PCR檢測大鼠心肌組織中CTGF mRNA的表達:取上述新鮮組織，用生理鹽水灌洗后，按Trizol試劑盒以及RT-PCR進行操作，凝膠掃描分析儀計算目的帶吸光度值，CTGF mRNA 表達的相對強度= CTGF條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

大鼠心肌組織CTGF的表達：參照SP試劑盒說明書進行操作，CTGF體積稀釋度1:200，利用圖像采集系統(tǒng)操作，隨機取每張圖片中的5個視野進行積分光密度值的測定，取其平均值作為標本值。Western-blot按照實驗操作手冊進行，CTGF體積稀釋度1:1 000；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）體積稀釋度1:2 000，最后用ChemiDocMP成像分析系統(tǒng)采集圖像，用積分吸光度比值（CTGF/GAPDH）作為其相對表達量。

2　結果

各組大鼠的一般情況：假手術組大鼠未見明顯異常，模型組大鼠皮毛不整，活動量減少，呼吸急促，肢體出現(xiàn)水腫；各用藥物組皮毛不整、呼吸急促、肢體水腫等明顯改善，灌胃給藥結束后模型組1只大鼠因慢性心力衰竭急性發(fā)作死亡。余組未見死亡。

各組大鼠血液動力學指標監(jiān)測結果比較（表1）：與假手術組相比，模型組大鼠的LVEDP、LVSP明顯上升，±dp/dt max顯著下降；與模型組相比，黃芪甲苷中劑量組和高劑量組的LVEDP、LVSP明顯下降，±dp/dt max顯著上升，黃芪甲苷低劑量組僅LVSP降低。上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

各組大鼠HW/BW、LVW/BW比值的比較（表1）：與假手術組相比，模型組大鼠HW/BW、LVW/ BW的比值明顯升高，黃芪甲苷低、中、高劑量組較模型組均有降低，隨著的黃芪甲苷劑量的升高，下降的幅度越大，具有明顯的劑量依賴性。差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1　各組大鼠血液動力學指標測定結果及HW/BW、LVW/BW結果比較（±s）

表1　各組大鼠血液動力學指標測定結果及HW/BW、LVW/BW結果比較（±s）

注：LVEDP:左心室舒張末期壓力；LVSP：左心室收縮壓；+dp/dt max：左心室內壓最大上升速率；－dp/dt max：左心室內壓最大下降速率。HW/ BW：心臟質量/體重；LVW/BW：左心室質量/體重。▲：灌胃給藥結束后模型組死亡大鼠1只。與假手術組相比*P<0.01；與模型組相比△P<0.05△△P<0.01。1 mmHg=0.133 kPa

組別　數(shù)量(只) LVEDP (mmHg) 　 LVSP (mmHg)　 +dp/dt max (mmHg/s) -dp/dt max (mmHg/s) HW/BW (mg/g)　 LVW/BW (mg/g)假手術組 　10　 4.94±0.90　 120.9±4.1　7327±391　6958±669　2.73±0.24　2.03±0.13模型組 　 11▲　20.94±1.66*　155.7±5.1*　4520±464*　4089±361*　3.73±0.31*　2.72±0.22*黃芪甲苷低劑量組 　12　 18.89±1.72　 145.7±7.3△　4850±391　4268±582　3.54±0.41△　2.43±0.19△△黃芪甲苷中劑量組　12　 13.74±1.04△△　132.2±5.5△△　5556±793△△　5048±284△△　3.24±0.29△△　2.37±0.24△△黃芪甲苷高劑量組 　12　 11.76±1.12△△　121.1±5.8△△　6477±491△△　5546±404△△　3.03±0.37△△　2.23±0.20△△

各組大鼠心肌組織切片結果（HE染色）的比較（圖1A～1E）:普通光鏡下觀察,假手術組中心肌細胞排列整齊、大小勻稱、細胞邊界清晰。模型組大鼠心肌細胞排列紊亂、肥大明顯，胞間內存在大量的纖維組織，同時伴有大量炎性細胞的浸潤。黃芪甲苷低、中、高劑量組心肌細胞輕度肥大，細胞排列尚整齊，伴有不同程度的纖維組織的增生，較模型組明顯減輕，隨著黃芪甲苷的劑量的增加，改善程度增強。

各組Masson染色結果以及CVF比較（圖2A～2E）：在Masson染色中，膠原蛋白被染色為藍色，心肌細胞染色為暗紅色。與假手術組的CVF （2.16±0.35）% 相比，模型組（7.64±0.42）%的明顯升高（P<0.01），與模型組CVF比值相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組（%，6.27±0.58、5.13±0.49、4.87±0.65）明顯的下降（呈現(xiàn)劑量的依賴性），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05）。

各組大鼠CTGFmRNA表達結果比較：同假手術組（20.15±7.42）相比，模型組（97.43±6.48）中CTGFmRNA平均積分吸光度值明顯增大（P<0.01）；同模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組（85.37±5.75、78.19±6.29、51.24±4.81）中CTGFmRNA的平均表達水平值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

各組大鼠免疫組化結果的比較：CTGF主要表達于心肌胞質中（圖3A～3E），表現(xiàn)為棕黃色的顆粒，心肌間質亦有少量的表達。同假手術組（0.09±0.03）相比，模型組（0.45±0.04）中CTGF平均積分吸光度值明顯增大（P<0.01）；同模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組（0.39±0.05、0.30±0.06、0.24±0.04）中CTGF的平均積分吸光度值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

各組大鼠Western-blot蛋白表達結果的比較（圖4）：同假手術組（0.15±0.02）相比，模型組（0.57±0.06）中心肌組織CTGF因子表達水平明顯增強；同模型組相比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組（0.44±0.05、0.35±0.02、0.28±0.03）心肌組織CTGF因子表達水平明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖1～3　各組大鼠心肌組織檢測結果（×400）

圖4　各組大鼠心肌組織CTGF因子的表達的蛋白免疫印跡圖

3　討論

CHF的演變過程中，細胞凋亡、細胞肥大以及心肌纖維化是心肌重構的基本特征，其中心肌纖維化是CHF發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素[6]。CTGF屬于CCN（即刻早期反應基因）家族成員，大小為38 kD左右，可為成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞分泌。作為一種具有趨化性和絲裂原性的細胞因子，CTGF可以介導細胞外基質的大量合成和沉積，使成纖維細胞激活為肌成纖維細胞，促進心肌組織的纖維化，同時CTGF還可通過促進諸如金屬蛋白酶組織抑制因子等蛋白酶抑制因子的表達來抑制細胞外膠原的降解，從而進一步加速CHF的進展[7]。既往研究已經(jīng)證實[8-10]，CHF大鼠模型以及心肌梗死后心肌組織中的CTGF表達明顯增強。

本研究采用國際上公認的腹主動脈縮窄術制作大鼠CHF模型，與假手術組相比，模型組大鼠LVEDP、LVSP顯著升高（P<0.01），±dp/dt max顯著的下降（P<0.01），同時達到國際CHF的指標（模型組大鼠LVEDP＞15 mmHg）。模型組中HE以及Masson染色中可見明顯的纖維化，同時心肌RTPCR、免疫組化以及Western-blot證實模型組心肌組織中CTGFmRNA以及CTGF蛋白表達較假手術組顯著的增多（P<0.01），進一步證實CTGF可以促進心肌纖維化生成，加速CHF的進展。

黃芪甲苷作為傳統(tǒng)的中藥制劑，既往研究已經(jīng)證實黃芪甲苷具有抑制心肌肥厚[11]、抑制心肌纖維化[12，13]、增強心肌收縮力[14]、改善能量代謝[15]等一系列的作用。本研究觀察黃芪甲苷不同劑量組與模型組進行比較發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織中的CTGF在免疫組化以及Western-blot雙重驗證中表達都是減弱的（P<0.01或P<0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴性。CTGFmRNA的表達也是具有類似的趨勢。同時心肌組織切片中，黃芪甲苷不同劑量組中的纖維化以及CVF也表現(xiàn)為不同程度的下降，呈現(xiàn)出劑量依賴性，與CTGF的表達水平相吻合。在血液動力學的監(jiān)測中，黃芪甲苷高、中劑量組LVEDP、LVSP較模型組明顯的下降（P<0.01或P<0.05），±dp/dt max顯著的上升（P<0.01），進一步的提證實黃芪甲苷的抑制纖維化的作用。

綜上所述，該研究推測黃芪甲苷能夠改善CHF大鼠心臟功能，減輕心臟的纖維化程度，可能是與其抑制心肌組織CTGF的過度表達有關，并呈現(xiàn)劑量的依賴性。因此，該實驗為黃芪甲苷治療CHF提供的新的依據(jù)，CHF的發(fā)生發(fā)展機制錯綜復雜，黃芪甲苷是否還通過其他機制抑制CHF的進展尚需進一步的研究。

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（編輯：曹洪紅）

收稿日期:（ 2015-08-12）

中圖分類號：R541

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）02-0165-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.015

作者簡介：蔣洪強 碩士研究生 主要從事慢性心力衰竭的藥物治療研究 Email:781694953@qq.com 通訊作者：張金國 Email:cck112000@aliyun.com

基金項目：山東省中醫(yī)藥科學技術研究項目（2013-235）；山東省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團隊計劃資助

目的：研究黃芪甲苷對腹主動脈縮窄術致慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌纖維化和結締組織生長因子（CTGF)表達的影響。

方法：SD雄性大鼠100只，采用腹主動脈縮窄術建立CHF模型，實驗分為假手術組(n=10)、模型組(n=12)和黃芪甲苷低、中、高3個劑量組（20、40、60 mg/kg, n=12），每日灌胃給藥1次，連續(xù)4周。4周后監(jiān)測血液動力學指標，處死大鼠后計算左心質量指數(shù)（LVMI），常規(guī)行蘇木素伊紅（HE）染色法觀察心肌組織形態(tài)學變化，Masson染色觀察心肌纖維化程度，測量心肌膠原容積分數(shù)（CVF），逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、免疫組化和蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測CTGF mRNA以及CTGF分子表達水平。

結果：同模型組相比：黃芪甲苷低、中、高劑量組LVMI水平減弱；CVF減弱；黃芪甲苷中、高劑量組的左心室舒展末期壓力下降、左心室收縮壓下降，左心室內壓最大變化速率上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05～0.01）。病理形態(tài)學明顯改善。同假手術組的CTGF平均積分吸光度值（0.09±0.03）、心肌組織CTGF因子表達水平（0.15±0.02）相比，模型組的（0.45±0.04）、（0.57±0.06）均增加；同模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組CTGF的平均積分吸光度值（0.39±0.05、0.30±0.06、0.24±0.04）和心肌組織CTGF因子表達水平（0.44±0.05、0.35±0.02、0.28±0.03）均降低，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

結論:黃芪甲苷能夠抑制CHF大鼠的心肌纖維化和改善心功能，具體作用機制可能是通過抑制心肌組織中CTGF的過度表達來實現(xiàn)的。