低氧對大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達的影響

李　敏，董子玉，陳學群

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低氧對大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達的影響

李敏，董子玉，陳學群

目的探討在低氧條件下SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表達，為闡明低氧腦水腫的發病機制提供依據。方法將12只SD大鼠隨機分為常氧組和低氧組，低氧組大鼠在低氧艙中模擬高原海拔7 000 m低氧(7.8% O2)中暴露8 h，通過Western blot檢測大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表達。結果在海拔7 000 m低氧暴露8 h后，SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達增多(P<0.05)。結論SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白在模擬高原海拔7 000 m低氧8 h后表達升高，提示HIF-1可能通過上調AQP4蛋白的表達參與了低氧腦水腫的發生。

低氧；腦水腫；水通道蛋白4；低氧誘導因子-1

人體的腦組織耗氧量大，對缺氧十分敏感，急性低氧可使腦組織水分異常過度集聚引起腦水腫。低氧腦水腫發生時腦體積增大、顱內壓升高，發展十分迅速，是可導致死亡的危急病癥[1]，如高原低氧環境可誘發腦水腫[2]。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一類廣泛分布于機體不同組織器官中的特異性跨膜轉運水的膜蛋白，其中水通道蛋白4(AQP4)主要分布于腦組織中，在生理和病理狀態下均參與細胞中水的轉運，在腦組織水平衡調節中起關鍵作用[3]。低氧條件下廣泛存在于各種人體細胞中的低氧誘導因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)是一種核轉錄調節因子，對機體低氧環境適應和調控起關鍵作用。本文模擬急性高原低氧環境，研究低氧腦水腫時AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達變化，探討低氧暴露時腦組織的損傷，為闡明低氧腦水腫的發病機制提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組雄性健康清潔級Sprague-Dawley大鼠，體質量(170±15) g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。實驗動物隨機分為常氧對照組和7 000 m(7.8%O2)低氧組，每組各6只。

1.2主要試劑及儀器蛋白裂解液(RIPA)、BCA法測定蛋白試劑盒與ECL化學發光試劑(上海碧云天生物技術研究所)，BSA(Biosharp，China)，蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific，USA)，兔源AQP4多克隆抗體(Merck Millipore，Germany)，小鼠源HIF-1α單克隆抗體(Novus Biologicals，USA)，內參GAPDH單克隆抗體(上海康成生物公司)，其他常規溶液為國產分析純試劑配制；低氧艙(貴州風雷航空軍械有限責任公司)，臺式冷凍離心機(Heraeus Biofuge Stratos，USA)，0.45 μm PVDF膜(Merck Milipore,Germany)，蛋白電泳儀器和凝膠成像系統(Bio-rad,USA)。

1.3低氧處理實驗大鼠分為常氧對照組和低氧實驗組。常氧對照組大鼠處于浙江省杭州市海拔100 m，含氧量20.9%，大氣壓為100.08 kPa。低氧實驗組大鼠置于低氧艙(1 m3)中以250 m· min-1速度升至所需海拔高度7 000 m(7.8%O2)，暴露低氧8 h。對照組大鼠放置于另一形狀大小相同的低氧艙中，但不給予低氧。

1.4腦含水量測定在低氧結束后迅速將大鼠取出斷頭犧牲，并迅速分離取出全腦，稱量濕重，然后將其置于120 ℃烤箱內，24 h烘至恒重后再稱量全腦干重。腦含水量計算公式為：[(濕重-干重)/濕重]×100%，按照該公式計算腦含水量百分比。

1.5蛋白提取低氧結束后大鼠出艙斷頭犧牲后，迅速取出大腦，用刀片取前額葉皮層約30 mg，置于配制好并且4 ℃預冷的裂解液中，然后勻漿提取蛋白。勻漿結束后，14 000 g 4 ℃離心20 min，取上清，分裝后于-20 ℃保存。1.6電泳和免疫印跡8% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳時采用3%濃縮膠80 V 30 min，8%分離膠120 V 100 min。200 mA轉膜2 h后，PVDF膜用TBST配制的5% BSA 37 ℃封閉2 h，然后再用PVDF膜分別和兔抗AQP4抗體(1∶2 000)、小鼠抗HIF-1α抗體(1∶500)和小鼠抗GAPDH抗體(1∶5 000)雜交，水平搖床4 ℃過夜(14～16 h)。TBST洗膜后PVDF膜再分別和相應的辣根過氧化物酶二抗山羊抗兔(1∶2 000)和山羊抗小鼠(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，將膜至于ECL中曝光，顯影，定影。

1.7分析采用Bio-Rad凝膠成像系統軟件對Western blot 結果進行分析。

2　結果

2.1低氧誘導大鼠腦水腫形成低氧8 h(模擬海拔7 000 m，7.8%O2)誘導大鼠腦含水量增加,常氧組為(76.46±0.42)%，低氧組為(78.01±0.57)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.1低氧誘導前額葉皮層AQP4蛋白表達增加與常氧對照組比較，低氧8 h(模擬海拔7 000 m，7.8%O2)大鼠前額葉皮層AQP4蛋白表達升高[常氧組：(58.86±6.14)%；低氧組：(101.02±16.87)%]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2低氧誘導前額葉皮層HIF-1α蛋白表達增加Western blot 實驗結果顯示：HIF-1α蛋白在大鼠前額葉皮層中有基礎表達，在低氧(模擬海拔7 000 m，即7.8%O2，8 h)處理后大鼠前額葉皮層中HIF-1α蛋白表達升高[常氧組：(11.20±2.75)%；低氧組：(20.04±3.78)%]，差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

低氧時HIF-1通過與低氧反應相關基因的低氧反應原件(hypoxia react factor，HRE)結合誘導下游靶基因，來介導低氧反應，調控機體的無氧代謝，使細胞能夠耐受低氧狀態而存活下來[4]。HIF-1由α和β兩個亞基組成，其中HIF-1α受氧濃度調節，是調節HIF-1活性的功能亞單位，與機體的急性低氧反應有關[5]。核磁共振結果顯示模擬高原海拔4 000 m低氧8 h即可以引起Wistar大鼠出現腦水腫，且隨著低氧程度加深，腦水腫也逐步加重[6]，SD大鼠在模擬高原海拔7 000 m低氧8 h后也出現腦水腫[7]。據報道，10 d新生大鼠頸動脈單側暫時性結扎24 h后梗死區形成腦水腫，免疫組化顯示梗死區域AQP4蛋白表達明顯上升[8]。AQP4參與腦組織的水調節，廣泛表達在神經膠質細胞中，在維持大腦的水平衡中起重要作用。在大鼠腦出血后的6 h，腦內含水量和血腫周圍的AQP4蛋白表達增加，且AQP4蛋白表達量與腦內含水量呈現正相關[9]。在水中毒腦水腫模型中，AQP4基因敲除小鼠腦組織含水量顯著減輕，生存能力增強，說明AQP4不僅參與了腦水腫的形成，并且起著重要的水調節作用[10]。本研究顯示，模擬高原海拔7 000 m低氧8 h促進大鼠前額葉皮層AQP4蛋白表達明顯升高，說明AQP4表達增多在急性低氧腦水腫的形成過程中起重要作用。

HIF-1作為轉錄因子，低氧時廣泛表達在腦、腎、肝和心臟等多種組織細胞中，是低氧狀態下細胞應答的重要物質。HIF-1α在常氧下半衰期<1 min，極易降解，但低氧下HIF-1α轉錄活性和穩定性都顯著增加[11]。同時低氧還可誘導HIF-1α蛋白集聚并且使HIF-1α與DNA結合的活性增加，激活下游的低氧相關靶基因[12]。Western blot和免疫組化結果顯示全腦缺血可以誘導大鼠皮層、海馬HIF-1α蛋白表達增多[13]。Bernaudin發現新生大鼠在8%O2低氧3 h后腦內HIF-1α表達顯著升高[14]。有研究證明利用RNA干擾技術抑制HIF-1α蛋白產生則可以有效減少大鼠的缺血損傷[15]。本研究發現，大鼠模擬海拔7 000 m 8 h急性低氧后前額葉皮層HIF-1α蛋白表達與對照組相比顯著升高，這與前述結果一致，提示HIF-1α蛋白表達增多可能與急性低氧誘導的腦水腫有關。

綜上所述，模擬海拔7 000 m急性低氧8 h誘導大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達顯著增加，提示AQP4蛋白和HIF-1α蛋白可能參與了急性低氧誘導的腦水腫，低氧條件下HIF-1可能通過對下游相關靶基因的調節上調AQP4蛋白的表達引起腦水腫。

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Effect of Hypoxia on Expression of AQP4 and HIF-1α in Protein in Prefrontal Cortex of Rats

LI Min,DONG Zi-yu,CHEN Xue-qun

(Xinyang Vocational and Technical College,Xinyang 464000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats under hypoxic conditions for the basis of elucidating the mechanism of hypoxic brain edema.MethodsTwelve SD rats were randomly divided into the normal oxygen group and the hypoxia group.Rats in hypoxia group were exposed to hypoxia (7.8% O2，equal to 7 000 m altitude) in a hypobaric chamber for 8 h.The expression of AQP4 and HIF-1α protein in rat prefrontal cortex were determined by Western blot.ResultsAQP4 and HIF-1α protein were enhanced in the hypoxic rat prefrontal cortex after exposure to 7 000 m hypoxia for 8 h (P<0.05) by Western blot.ConclusionThe expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats were increased after 8 h hypoxia.It was showed that HIF-1 might contribute to hypoxic brain edema by increasing the expression of AQP4 protein.

hypoxia；brain edema；aquaporin 4; hypoxia induced factor-1；HIF-1α

1672-688X(2016)03-0174-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.004

2016-05-10

信陽職業技術學院，河南信陽 464000

李敏(1987-)，女，河南信陽人，講師，從事生理學教學工作。

陳學群，女，教授，博士生導師，E-mail：chewy@zju.edu.cn

R364.4,R338.2+5

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