不完全型雄激素不敏感綜合征產前診斷研究*

吳維青 文華軒 袁 暉 謝建生**

1. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院中心實驗室（深圳 518032）；

2. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院超聲科；3. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院產科

·論 著·

不完全型雄激素不敏感綜合征產前診斷研究*

吳維青1文華軒2袁 暉3謝建生1**

1. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院中心實驗室（深圳 518032）；

2. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院超聲科；3. 南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院產科

目的對不完全型雄激素不敏感綜合征（Partial Androgen Insensitivity Syndrome, PAIS）一家系進行病例報道及遺傳分析，并對高危胎兒進行產前診斷。方法分析患者雄激素受體（AR）基因序列及第一外顯子內的CAG重復，結合核型及產前超聲判斷胎兒是否罹患PAIS。結果2名患者AR基因編碼區及側翼序列未見異常，男性胎兒獲得了與疾病相關的CAG重復次數，超聲檢查提示其外生殖器發育異常。結論本研究對一個PAIS家系進行了遺傳分析，雖未能明確AR基因突變，但連鎖分析及產前超聲均提示男性胎兒罹患PAIS。本研究可為同樣病例的遺傳分析、產前診斷和遺傳咨詢提供借鑒資料。

不完全型雄激素不敏感綜合征；雄激素受體基因；產前診斷；連鎖（遺傳學）

Key woordspartial Androgen Insensitivity Syndrome（PAIS）；androgen receptor gene；prenatal diagnosis；Linkage （Genetics）

雄激素不敏感綜合征（ardrogen insenstivity syndromes, AIS）是由位于Xq11.12的雄激素受體基因（androgen receptor，AR）突變所致的X連鎖隱性遺傳病，根據表型輕重可分為完全型雄激素敏感綜合征（complete androgen insensitivity syndrome, CAIS）和不完全型雄激素敏感綜合征（partial androgeninsensitivity syndrome, PAIS, MIM #312300）。PAIS患者為男性，但具有程度不等的外生殖器發育異常（陰莖短小、尿道下裂）、生育功能低下、乳房發育等女性第二性征。PAIS發病率低于CAIS，但具體的發病頻率尚不清楚［1］。

據統計，已報道的引起PAIS的AR基因（CAG）突變已超過100多種［2］，主要位于編碼AR蛋白非關鍵功能區域內。同一種突變在不同家系導致的臨床表現輕重程度可明顯不同，攜帶同一突變的同一家系成員臨床表現也不盡相同。鑒于經典基因突變檢測一般僅局限于外顯子及側翼序列等多種原因，并非所有AIS疑似患者均能檢測到AR基因突變［3］。AR基因第一外顯子內存在一個CAG三核苷酸重復，其重復次數的增加與脊髓延髓肌肉萎縮癥、乳腺癌、前列腺癌、子宮及內膜癌、男性不育等多種疾病相關［4,5］。CAG重復次數范圍在人群中呈明顯的多態性，且具有種族差異，中國人此位點亦呈明顯的多態性［6］，有研究表明中國漢族人群CAG重復具有高度的遺傳多態性（雜合度為0.833，多態信息量為0.88）［7］，屬于較好的連鎖分析標志。

國內已有一些關于CAIS患者AR基因突變的報告［8,9］，但對PAIS，卻只有少數病例報告［10-12］及尿道下裂患者AR基因突變研究［13］。本研究對一個典型的PAIS家系的2名患者進行AR基因突變檢測，綜合利用連鎖分析、遺傳學性別鑒定及產前超聲檢查明確胎兒是否罹患PAIS，為同類病例的遺傳學診斷及遺傳咨詢提供借鑒資料。

資料與方法

一、研究資料

一個PAIS家系（見圖1），共有5名患者，呈現典型X連鎖隱性遺傳特征。先證者（Ⅳ7），男，7歲，出生時即發現陰莖短小、尿道下裂，于2歲時行尿道成形術，染色體核型為46, XY。先證者舅舅（Ⅲ5），男，34歲，出生時也有陰莖短小、尿道下裂，行陰莖成形矯正手術后可勃起；精液分析提示少精子、死精子；未能生育子女；多次因乳房發育行乳腺組織切除手術；其性激素6項檢查結果顯示睪酮（T）、雌二醇（E2）及促黃體生成素（LH）偏高，具體數值為：T 8.45μg/L（1.75～7.81）、孕酮（P）1.16μg/L（0.14～2.06）、E265pg/mL（20～47）、泌乳素（PRL）5.06μg/L（2.64～13.13），LH 13.90IU/L（1.24～8.6）、促卵泡生成素（FSH）12.43IU/L（1.3～19.3）；染色體核型為46, XY。家系中其他患者均有類似情況，且均未能生育子女。家系遺傳方式、患者的臨床表現及實驗室檢查符合PAIS的診斷。先證者母親（Ⅲ6），31歲，孕11周時來我院就診，要求進行基因診斷和產前診斷，簽署知情同意書，于孕17周行羊水穿刺術。

二、方法

1．DNA提取：外周血及羊水標本，以QIGEN試劑盒提取基因組DNA。

2．AR基因突變檢測：根據AR基因序列，應用primer 5 軟件自行設計引物，對2名患者AR基因8個外顯子及測序序列進行分析，計數外顯子1內CAG重復次數。

3．CAG重復連鎖分析：根據AR基因exon1序列，參考文獻［14］設計包含重復序列的一對引物，正向引物以熒光標記，產物于CEQ8000遺傳分析儀上進行片段分析。檢測患者、胎兒及家系中其他相關個體共7例（Ⅱ2、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ6、Ⅳ7、Ⅳ8）片段長度，判斷重復次數在家系中是否具有多態性以及與疾病的關聯情況。

4．G染色體核型分析：羊水細胞貼壁培養，之后常規G顯帶核型分析，判斷胎兒遺性別及染色體是否正常。

5．胎兒超聲檢查：高危胎兒孕24周左右，以西門子512彩色超聲成像儀進行胎兒三維超聲檢查，尤其關注胎兒內外生殖器發育情況。

結 果

一、AR基因突變檢測結果

2名患者（Ⅲ5、Ⅳ7）AR基因各外顯子及側翼序列均未見堿基改變。

二、AR基因exon1片段分析結果

片段分析及測序結果提示2名患者（Ⅲ5、Ⅳ7）CAG重復均為21次（305bp）。Ⅱ2、Ⅲ4、 Ⅲ6、Ⅳ6、Ⅳ8片段長度為305/317、305/308、305/308、308、305bp。可以看出21次重復自Ⅱ2傳遞給Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6，男性個體Ⅲ5發病，而女性個體Ⅲ4、Ⅲ6攜帶，Ⅲ4未將其傳遞給后代Ⅳ6，而Ⅲ6傳給兒子Ⅳ7及胎兒Ⅳ8。所有獲得了21次重復的男性個體均有生殖器異常，表明其與疾病連鎖共分離，見圖1。

三、 G染色體核型分析結果

G顯帶核型分析結果顯示胎兒為正常男性核型46，XY。

四、 胎兒24周超聲檢查結果

孕24周+6d，男性胎兒，陰莖偏小，形態異常，陰莖陰囊部分扭轉伴隨尿道下裂，見圖2。

五、妊娠結局

孕婦知悉以上結果選擇放棄胎兒，引產胎兒證實外生殖器確有尿道下裂等畸形。

圖1 PAIS家系圖譜及連鎖分析結果

圖2 孕24周胎兒生殖器超聲圖像

討 論

PAIS患者的表現輕重不同，臨床診斷上相對困難。PAIS患者基礎狀態的T和LH較正常男性明顯增高，因T可以轉化為雌激素，故而多數患者E2水平也同時增高［15］。根據臨床表現、典型的激素水平以及X連鎖隱性遺傳家族史，即可診斷為PAIS［15,16］。本研究家系呈現明顯的X連鎖隱性遺傳特性，所有患者生殖器均發育不良，而且成年患者均有乳腺發育及不育，一例成年患者性激素T、LH、E2增高情況也符合PAIS特征，因此PAIS的診斷明確。

對此家系2名患者的AR基因進行了較為仔細的測序分析，遺憾的是未能找到致病基因突變。而根據相關研究，一半以上的PAIS患者不能明確基因異常位置［2］，其原因可能是突變存在于AR基因的非編碼區、內含子或者基因的調控區。隨著現代測序技術的進步，后續研究可以對AR基因進行擴大范圍檢測，有望明確患者的基因變異。

PAIS患者社會性別為男性，癥狀較社會性別為女性的CAIS輕，但具有男性化不足、女性第二性征和生育功能缺陷等，給患者本人和家屬帶來更大、更長期的生理及心理負擔，即使手術可以部分矯正異常，但也無法恢復到正常男性的生理功能［17］。當一個家庭出現PAIS患者時，明確突變類型并進行產前診斷是避免患兒出生和降低再發風險的唯一途徑。

孕中期超聲可以發現多種胎兒生殖器的異常［18］，但生殖器畸形病因繁多，需進行鑒別診斷。有研究者認為，對于單純尿道下裂胎兒來說，首先要考慮的就是部分型雄激素不敏感綜合征（PAIS）存在的可能［19］。此高危胎兒核型分析明確為男性，超聲發現其陰莖短小、陰莖陰囊部分扭轉及尿道下裂，再結合家系遺傳方式及兩名患者的臨床表現和實驗室檢查，可以確定胎兒罹患PAIS。

因基因突變無法明確這就給產前診斷帶來了極大的困難，在這種情況下，對家系成員進行連鎖分析并結合臨床資料推斷胎兒是否罹病，雖然是退而求其次的辦法，但是對家系避免再次出現PAIS同樣具有非常重要的意義。AR基因第一外顯子CAG重復在中國人群屬于高度多態的位點，并且就在致病基因內部，與疾病高度連鎖，因此可視作AIS較好的連鎖分析標記。我們發現CAG的21次重復（305bp）在此家系與PAIS表型共分離，高危男性胎兒恰巧獲得了此標記，提示遺傳到了與疾病連鎖的AR基因，超聲及引產發現的生殖器畸形也證實胎兒的確罹患PAIS，從而證實連鎖分析的可靠性。國際上，也有應用此CAG重復鑒定致病AR基因，從而進行產前診斷的研究報告［20］。綜述分析，應用AR基因exon1的CAG重復進行連鎖分析，有益并且切實可行。

本研究對一個PAIS家系進行產前診斷，雖然沒有能夠找到AR基因突變，但結合AR基因內部的CAG重復次數與疾病的連鎖關系及產前超聲影像胎兒生殖器畸形情況，明確胎兒罹患部分型雄激素不敏感綜合征，為不能明確突變類型的CAIS及PAIS家系產前診斷提供一個較好先例，對AIS的遺傳學診斷和優生咨詢均具有一定的借鑒意義。

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（2016-05-08收稿）

Genetic analysis and prenatal diagnosis in a family with partial androgen insensitivity syndrome＊

Wu Weiqing1, Wen Huaxuan2, Yuan Hui3, Xie Jiansheng1**
1. Central Laboratory, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital, Shenzhen 518028, Guangdong, China；2. Department of Ultrasonography, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital, Shenzhen；3. Department of Obstetrics, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital

Xie Jiansheng, Email:jianshengxie2000@aliyun.com

Objective To detect AR gene mutation in 2 patients of a partial androgen insensitivity syndrome family and perform prenatal diagnosis for the high risk fetus.MethodsEight exons and at least 100bp fl anking intrinsic sequence of AR gene were screened by PCR and direct sequencing. CAG repeats in exon1 of AR gene was used as a STR marker in linkage analysis. The amniocentesis was performed for determination of genetic gender and linkage analysis. The Fetal genital anomalies were scanned by color Doppler ultrasound.ResultsNo mutation was found in two patients' AR gene. Linkage analysis indicated that the 21 times of CAG repeats was related to the phenotype in this family. The male fetus inherited the 21 times repeat of CAG, and antenatal sonographic diagnosis showed its external genitals was abnormal（micropenis, perineoscrotal hypospadia）.ConclusionMale fetus was still diagnosed as PAIS based on the results of linkage analysis and sonographic diagnosis, although no specific mutations of AR gene were detected in PAIS patients.

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.001

R714.55

資助：本課題受深圳市科技研發資金基礎研究項目（JCYJ201504020904413001）；國家自然科學基金項目（31471204）

**通訊作者，E-mail:jianshengxie2000@aliyun.com