一種脫細胞真皮基質（A D M）制備方法的實驗研究△

王志遠　王富生　朱偉東（深圳市龍崗區第二人民醫院燒傷整形外科　深圳518112）

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一種脫細胞真皮基質（A D M）制備方法的實驗研究△

王志遠王富生朱偉東（深圳市龍崗區第二人民醫院燒傷整形外科深圳518112）

摘要：目的：優化實驗條件，建立提取脫細胞真皮基質的可靠方法。方法：選擇20例包皮環切術后切除包皮為研究材料，用胰蛋白酶的消化方式、高滲鹽水分離皮膚表皮，用去垢劑法和胰蛋白酶去除真皮細胞成分，用組織病理學，抗原性和生物原性觀察制備后細胞真皮基質進行鑒定。結果：20例同種異體真皮在組織學、抗原性及生物原性體征方面符合真皮基質的特性。結論：用酶消化法分離皮膚表皮，用酶消化法祛除真皮細胞成分，方法可靠，操作簡單，制備脫細胞基質，符合真皮基質的特征，制成的真皮基質真皮基底膜完整，抗原性小，是理想的組織修復材料。

關鍵詞：脫細胞真皮基質生物敷料組織修復同種異體真皮

大面積深度燒傷需進行皮膚移植修復創面，自體皮源缺乏是治療大面積燒傷難點，故研究真皮替代物具有重要意義，脫細胞真皮基質（ADM）是近幾年國外興起的一種真皮替代物，是利用特定的方法將皮膚中的細胞成分去除，僅保留真皮中含膠原網架的細胞外基質。根據制備材料的來源分為同種異體真皮基質（Alloderm）與異種真皮基質（Xenoderm）兩種。作為真皮替代物治療全層皮膚缺損的效價在于它的低抗原性、快速血管化和作為表皮載體或支架的穩定性，這些特性很大程度上取決于ADM的最終成分。如今ADM的應用已遠遠超出作為單純真皮替代物的范圍，廣泛應用于燒傷與整形科等領域。本課題為深圳市龍崗區科技局立項課題（YL2013164），著重研究酶消化法、高滲鹽法、酶溶解法、去垢劑法進行ADM的實驗室制備。

1　材料和方法

1.1一般資料：本實驗所用20例整形外科切除廢棄包皮組織，研究材料均來自本院整形外科門診和住院病例，所取包皮組織為手術整形切除組織，標本取材前說明目的并征得同意，患者術前檢查排除傳染性疾病和慢性疾病。包皮組織均來自成年男性，年齡18～38歲，病程18～38年。

1.2標本處理：切取過長包皮組織放置在無菌袋中，4℃冰箱保存，術后環形遠端包皮從一側切口展開，形成平面，用剪刀修剪展開包皮，剪除殘留皮下組織、毛囊等皮膚附屬組織備用。

1.3制備過程

1.3.1表皮和真皮層分離的方法：采用酶消化和高滲鹽水分離法分離表皮和真皮。酶消化法用的消化酶選擇0.25%胰蛋白酶液200mL，放置實驗包皮，置4℃冰箱24h，組織切片染色觀察。高滲鹽水分離法是將標本浸泡于1mmol/L氯化鈉200mL溶液中，相同放置條件，利用高滲的原理，使錨著細絲與表皮基底細胞的半橋粒分離,從而完整地去除表皮，24h后組織染色切片觀察。

1.3.2去除真皮中細胞成分的方法

1.3.2.1去垢劑法：去垢劑是一類可溶于水的脂類，它有親水部分和疏水部分，能裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫復合物。本課題選擇十二烷基硫酸鈉為去垢劑，其在溶液中的穩定性高，不易受強電解質如無機鹽等的影響，能與生物膜中的磷脂等脂質結合形成復合物；同時十二烷基硫酸鈉中的疏水端也能和膜蛋白結合破壞生物膜,從而使細胞溶解。該法脫除細胞徹底，但同時對基底膜結構破壞大不利于上皮細胞的黏附生長。

1.3.2.2生物酶法：采用胰蛋白酶作為脫細胞劑，本課題選擇0.25%胰蛋白酶，在此基礎上研究聯合使用，觀察是否能縮短制作脫細胞基質時間，是否更能促進真皮基質的無細胞化、保留更多的基底膜和降低抗原性。

1.4ADM的鑒定：在物理性質，組織學觀察，抗原性和生物原性觀測，制備ADM進行臨床預實驗，為今后臨床應用打下基礎。

2　結果

采用酶消化法及高滲鹽水法分離表皮，用酶消化法和去垢法去除真皮細胞成分，我們共制備脫細胞真皮基質20例人同種異體脫細胞真皮基質，將所得脫細胞真皮基質組織病理學及抗原性檢測結果如下：

表1　酶消化法及高滲鹽水法分離表皮

表2　去垢法及酶消化法脫真皮中細胞成分

表3　郎罕氏細胞及細胞染色

3　討論

皮膚移植是救治大面積燒傷、嚴重創傷的關鍵措施之一，雖然自體皮膚移植是覆蓋全厚皮膚缺損創面的最好方法，但是，大面積燒傷患者的自體皮源常常不足，不得不尋求其他生物敷料，具有機械性和生理性保護作用的異體皮是目前較好的生物敷料，目前脫細胞真皮基質（allogenic acellular dermalmatrix，allo-ADM）及異種（豬）脫細胞真皮基質（xenogenic acellular dermal matrix，xeno-ADM）已在臨床應用，但異體皮在移植后因機體的排斥反應不能長期存活。各種深度燒傷需修復創面，由于大面積燒傷自體皮源缺乏，造成治療困難，研究真皮材料，對大面積燒傷救治，整形外科填充材料研究具有臨床前景[1]。

皮膚由表皮和真皮組成，表皮為上皮組織，真皮為不規則的致密結締組織。表皮由角化的復層鱗狀上皮組成，分為角質層、透明層、顆粒層和生發層四層，其中生發層和角質層是表皮基本結構。除復層鱗狀上皮（角質形成細胞）外表皮還有一類非角質形成細胞，它散在于角質形成細胞之間，如郎格罕斯細胞和黑色素細胞。真皮位于表皮深層，分為乳頭層和網織層。乳頭層內膠原纖維排列不規則，彈性纖維和網狀纖維含量較少，各類結締組織細胞較多，常見有成纖維細胞、肥大細胞、組織細胞和淋巴細胞等。網織層由粗大的膠原纖維組成，膠原纖維之間有較多的彈性纖維，即起到真皮支架的作用。皮膚基本結構中表皮和真皮結構中含有上述細胞成分與免疫密切相關，這些細胞表面表達高密度的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子，它們是皮膚的APC，在皮膚移植排斥中發揮重要的作用，其中最重要的細胞為郎格罕斯細胞和角質細胞。實驗表明，注射郎格罕斯細胞可明顯加速皮膚移植物排斥和異體角質細胞注入真皮內可見明顯的排斥反應。由于皮膚功能及再生能力有限，在大面積燒傷患者應用全層的豬皮或者尸體的全厚皮膚覆蓋創面起到安全過渡休克期和急性感染期，但是由于移植皮膚內的細胞引起排斥反應，異體皮膚不能長期存活。所以設想從異種或異體真皮內除去誘導免疫排異的上皮細胞和內皮細胞成分,得到保持真皮原有結構、以真皮膠原為主體的低抗原性真皮替代物（DS），可減少或消除異種和異體真皮移植后的排異反應，達到上文所述的免疫耐受，以期移植物長期存活。這一設想首先由Wainwright，Livesey在異體無細胞真皮基質、動物實驗和臨床應用方面得到證實，作為網狀自體刃厚皮片載體，獲得較高的成活率，在短期覆蓋創面方面起到很好的作用。國內燒傷界同行陳璧[2]，孫永華應用異體無細胞真皮基質結合超薄皮片在大面積燒傷患者，同樣取得較高的生存率和比較滿意的功能。雖然異體無細胞真皮基質移植取得較好的臨床應用效果，但由于異體皮膚來源少，近年來,為進一步拓寬真皮替代物來源、擺脫異體皮膚存在的不足因素,人們再一次把目光轉向無細胞異種真皮基質的研究應用。由于動物實驗存在嚴重的炎癥反應導致創面愈合不良，國外對xeno-ADM仍持有審慎的態度，但國內已過渡到臨床應用上。通過反復凍融法，滲透溶液法，酶消化法和化學去污劑法等脫細胞法脫去異種真皮組織內含有大量抗原性較強的細胞成分,包括附件上皮細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞、郎格漢斯細胞和成纖維細胞等。脫細胞后，真皮剩余的大部分為低抗原性非細胞成分，主要包括基質蛋白和膠原，但是仍會殘留的免疫原性較強細胞膜抗原和基質蛋白，從而引起較強的免疫排斥反應[3]。

本課題研究從廢棄包皮中制備脫細胞真皮基質，并在實驗條件下探索制備方法，為進一步研究同種異體生物真皮替代物生物特性。從本課題用胰蛋白消化法、高滲鹽溶液分離包皮表皮，實驗發現酶消化法真皮分離完整，組織學觀察，基底膜完整[4]，而高滲鹽法表皮分離有表皮殘留，基底膜基本完整，此觀察與方林森等[5]，采用高滲鹽-胰蛋白酶法制備脫細胞真皮基質研究結果相符，采用高滲鹽-胰蛋白酶法制備脫細胞基質方法達到既能脫去表皮層細胞成分，又使基底膜完整連續，膠原彈力纖維結構及排列正常的雙重目的，ADM柔韌性好、不斷裂、無細菌生長。但分離表皮后，真皮中存在細胞成分，尤其是郎罕氏細胞，是發生排除反應主要成分，先期組織學電鏡觀察，發現標本中可見到細胞成分，需進一步處理，制備具有完全脫細胞成分真皮基質，用去垢劑法和酶消化法再次進行脫細胞處理，組織學電鏡染色觀察，兩種方法均可以去除95%以上細胞成分，尤其是胰蛋白酶法不但能去除真皮成分，而且能保留真皮基底膜完整，去垢劑法去除細胞效果與胰蛋白酶法基本一致[6]，但觀察發現基底膜完整性有差別。用去垢劑（十二烷基硫酸鈉）、胰蛋白酶等去除真皮中細胞成分，能完全去除真皮細胞成分，不改變真皮中彈力纖維和膠原纖維的結構，制備工藝可操作性強，是一種簡單有效的制備方法。

4　結　論

用酶消化法分離皮膚表皮，用酶消化法除去真皮細胞成分，方法可靠，操作簡單，制備脫細胞基質，符合真皮基質的特征，制成的真皮基質真皮基底膜完整，抗原性小，是理想的組織修復材料。

參考文獻

[1]馬紹英，李寶興，賴熾香，等.無細胞真皮基質的研究[J].山西醫藥雜志，2007，36（4）：313.

[2]姜篤銀，陳璧，徐明達，等.異種脫細胞基質的制作和臨床應用觀察[J].中華燒傷雜志，2002，18（1）：15-18.

[3]史新立，譚芳奕，陳冰.脫細胞真皮基質的材料的研究及應用[J].中華損傷與修復雜志（電子版），2009，4（4）：55-56.

[4]伍津津，朱堂友，魯元剛，等.表皮真皮分離方法的探索[J].第三軍醫大學學報，2004，26（24）：2242-2244.

[5]方林森，王春華，胡德林，等.制備脫細胞真皮基質的實驗研究[J].安徽醫科大學學報，2005，40（1）：20-22.

[6]車鵬程，孫紅，劉麗，等.三種無細胞基質制備方法的比較[J].山東醫藥，2008，48（35）：101-102.

基金項目：△深圳市龍崗區科技局基金（YS2013142）。

中圖分類號：R622

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）01-0100-02