鹿鉤端螺旋體病的病原學診斷

官福躍官福峰

(1.吉林省前郭縣畜牧工作總站，吉林前郭 138000；2.吉林省前郭縣動物疫病預防控制中心，吉林前郭 138000)

鹿鉤端螺旋體病的病原學診斷

官福躍1官福峰2

(1.吉林省前郭縣畜牧工作總站，吉林前郭 138000；2.吉林省前郭縣動物疫病預防控制中心，吉林前郭 138000)

鹿鉤端螺旋體病，又稱鹿血尿病，是由鉤端螺旋體引起的一種急性傳染病。其臨床特征是短期發(fā)熱、黃疸、血尿。

鉤端螺旋體病；鹿；診斷

1 病料采集

病鹿生前在發(fā)熱期間未出現黃疸前頸靜脈采取血液，加1/10量的10%枸櫞酸鈉或1%草酸鈉溶液混合。發(fā)病6～10d后采取中段尿液。采取實質器官如肝、脾、腎、腦等應不遲于死后1～3h。

2 鏡檢

（1）材料。液體材料均用1500轉/min離心5mn，血液標本取上層液，尿標本取上清液，再以3000～4000轉/min離心1～2h，然后取沉淀物制片。肝、腎組織制成1：5或1：10懸液，用1500轉/ min離心5min，取上清液制涂片；或再以3000轉/min離心0.5～1h，然后取沉淀物制片。

（2）用姬姆薩染色法。涂片自然干燥，浸于盛有甲醇的玻璃缸中或滴加甲醇數滴于玻片上固定3～5min，干后將玻片浸于盛有姬姆薩染色液的染色缸中，染色0.5h至數小時，水洗，吸干鏡檢，鉤端螺旋體呈紅色或紫色。

（3）方登納氏鍍銀染色法。標本制成薄層涂片，自然干燥；用固定液（冰醋酸1毫升、40%甲醛10ml及蒸餾水100ml混合）1～2min；加無水乙醇數滴，洗去固定液；滴加鞣酸媒染劑（鞣酸5g、蒸餾水100ml），并加熱使發(fā)生蒸汽，染色30min；用水沖洗后，滴加經氨液處理的硝酸銀溶液（硝酸銀5g、蒸餾水100ml，取20ml，滴加10%氨液至所產生的褐色沉淀經搖動后恰能完全溶解為止，然后再滴加硝酸銀溶液數滴，以溶液于搖勻后仍顯輕度渾濁為度），加熱使產生蒸汽，染30min；水洗、干燥，加蓋玻片，用加拿大樹膠固封，用油鏡檢查。可見底黃，菌黑，菌體與背景界限清晰，菌體形態(tài)大多數為兩頭尖的梭形，有部分沒有螺旋，有時菌形彎曲如蚯蚓，菌體長短與紅細胞直徑相似。

（4）鉤端螺旋體媒染法。抹片經火焰固定后用生理鹽水漂洗；加媒染劑（鞣酸2g、鉀明礬1g及中國藍0.25g，加于20%乙醇100ml中，充分溶解后過濾即成）5min；水洗后，用染色液（石炭酸復紅及堿性美藍染色液等量混合過濾即成）染色2min；水洗晾干后鏡檢。鉤端螺旋體呈淡紅色，背景淡藍色。

3 病原分離培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基。鉤端螺旋體常用培養(yǎng)基為柯托夫（Korthof）氏培養(yǎng)基、捷爾斯基赫氏培養(yǎng)基和希夫納氏培養(yǎng)基等。

柯托夫氏培養(yǎng)基：蛋白胨0.8g，氯化鈉1.4g，氯化鉀0.04g，碳酸氫鈉0.02g，磷酸氫二鈉（含2H2O）0.96g，磷酸二氫鉀0.18g，1%氯化鈣溶液4ml，蒸餾水1000ml。于l00℃加熱30min，冷后調pH至7.2。分裝試管每管5ml或10ml，以30min滅菌。

捷爾斯基赫氏培養(yǎng)基：取M/15磷酸氫二鈉溶液8ml與M/15磷酸二氫鉀溶液2ml混合，再加入蒸餾水90ml即可。定量分裝，滅菌方法同上。

上述培養(yǎng)基用前無菌加入10%健康兔血清（經56～58℃水浴滅能2h），即可供培養(yǎng)用。

（2）病原培養(yǎng)方法。①無菌采取病鹿血液，同時接種三管培養(yǎng)基，第一管加1滴、第二管加2滴、第三管加3滴。②無菌采集病鹿新鮮中段尿液接種于數管培養(yǎng)基內，也可以3000轉/min離心30in，取沉淀物1～2ml進行培養(yǎng)。為防尿內污染雜菌，可在培養(yǎng)基內加入0.05磺胺嘧啶，亦可用賽氏濾器濾出雜菌。③用作培養(yǎng)的臟器主要是肝和腎。用吸管采集。為了從臟器內的不同部位多吸取些粉碎的組織出來，將插入臟器內的吸管扭向不同方向，取得的材料接種到2～3管培養(yǎng)基內。也可用無菌剪刀剪碎組織進行培養(yǎng)。

（3）分離培養(yǎng)物的鑒定

①培養(yǎng)特性：將已接種的培養(yǎng)管置于28～30℃溫箱內。每5天作一次懸滴壓片在暗視野顯微鏡下觀察其生長情況。鉤端螺旋體通常在7～20d內開始生長，有時要到30～60d，甚至90d才出現。

②生化特性：鉤端螺旋體不發(fā)酵糖類，不產生H2O2，過氧化氫酶試驗陰性，有輕度的還原作用。對氧化物敏感，在人工培養(yǎng)基上繼代可逐步消失致病性，但連續(xù)通過動物體則可保持其致病性不變。

③菌體形態(tài)：菌體形態(tài)大多數為兩頭尖的梭形，有部分沒有螺旋，有時菌形彎曲如蚯蚓，菌體長短與紅細胞直徑相似。

（4）動物接種

①試驗動物：14～18日齡仔兔（體重250～400g）、幼齡豚鼠（體重150～200g）、20～25日齡的仔犬以及地鼠對鉤端螺旋體的敏感性較高。接種前應測量2～3d體溫，正常者才可應用。

②接種材料：從發(fā)病3～5d的患病鹿采集血液，立即給動物腹腔注射，劑量為豚鼠、地鼠3ml，仔兔、仔犬5ml。采集中段尿直接或經離心取沉淀物給動物腹部皮下注射。注射前可在尿內混加適量磺胺嘧啶。尿液的注射量為5～10ml。取死亡動物的肝和腎（重量不超過5g），在瓷乳缽內充分研磨，加生理鹽水10ml，制成懸液，給動物腹腔注射，劑量為豚鼠和地鼠1～2ml，仔兔和仔犬3ml。

③觀察：試驗動物接種后，每日測溫和稱重。第1周內可隔日采心血培養(yǎng)一次。如經過2周動物仍不發(fā)病，應先采心血作凝集溶解試驗，然后宰殺取其肝、腎組織分別培養(yǎng)。如果被檢血清凝集溶解試驗呈陽性反應，可應用同樣動物盲目傳3代。

[1] 魏鐵鎮(zhèn)，姜丹，王猛，等.鹿鉤端螺旋體病的診斷與防治[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2008，29（1）：20.

官福躍（1976—），女，本科學歷，中級，主要從事動物畜牧獸醫(yī)工作。