豬瘟疫苗生產中存在的問題及工藝改進

郭德民

(哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江哈爾濱 150036)

豬瘟疫苗生產中存在的問題及工藝改進

郭德民

(哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江哈爾濱 150036)

瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)雖然僅有一種血清型，但是其有毒力的強弱之分，如果豬的本身有疾病，則免疫就會失敗而達不到免疫的效果。本次研究主要通過對豬瘟疫苗生產中的問題進行探討，進一步的對豬瘟疫苗生產工藝進行研究。

豬瘟疫苗；豬瘟病毒；生產工藝

當前三種最為常見的豬瘟疫苗是豬瘟乳兔組織活疫苗（組織苗）、豬瘟細胞活疫苗（細胞苗）、豬瘟脾淋活疫苗（組織苗）。給健康的豬接種組織苗同細胞苗的效果相同，如果是緊急接種則組織苗比細胞苗好，主要原因是在組織苗當中的部分組織蛋白，尤其是脾淋苗當中的淋巴因子是免疫促進劑。必須要注意的就是在超前免疫當中不能使用組織苗，因為組織苗對還沒有吃到初乳的豬仔能夠引發較為嚴重的免疫應激反應。

1 豬瘟疫苗生產工藝當中存在的問題

1.1 豬瘟病毒培養難

在滴度較低的豬瘟細胞毒轉瓶的生產過程當中，病毒的粒子在細胞當中成熟之后就會釋放到營養液當中，進而致使部分的病毒粒子活性喪失。生產過程當中，不容易對打次收獲病毒的方式進行控制，總的毒價在多次收獲病毒之后降低；體外進行培養的細胞當中，CSFV保持較低水平的增殖，產生出的子代病毒有較低的滴度。因此進而配苗抗原就難達到均以穩定質量標準。

1.2 豬瘟病毒抗原的檢測方法落后

當前進行增殖的CSFV包括豬腎細胞、羊睪丸細胞還有豬睪丸細胞，一般性的細胞培養過程不會發生細胞的病變，使用兔體的反應量對抗原進行間接性的檢測，對抗原進行定量較為困難，對目前疫苗的生產質量影響嚴重。

1.3 疫苗的效力標準過低

C柱疫苗免疫在歐洲的藥典當中規定進行肌肉注射的劑量是100PD。而在我國進行豬瘟苗免疫所規定的標準劑量是37PD。與國際標準相比，我國的標準劑量過低。

1.4 生產方法較為落后

抗原所存在的生物安全性隱患采用兔的淋巴結、脾臟以及乳兔的組織來進行生產。牛病毒性腹瀉病毒污染嚴重威脅著牛睪丸細胞苗；兔源影響兔脾淋苗，有著質量不穩定問題。疫苗的效力檢驗以及抗原質量的控制均使用較為落后的兔體致熱法，檢驗時需要較大量的兔子，質量指標穩定較難。接種之后兔子能發產生發熱反應與兔子對病毒的敏感性以及外界因素有關。顯然，如果在接種過程當中兔子感染了別的病原，則不能說明發熱反應是因為接種了豬瘟病毒引起的。另外，脾淋苗生產的成本較高，許多廠家是否采用未曾接種的兔子來做脾淋苗值得懷疑。兔子的大小、品種以及健康狀況都會對豬瘟病毒在體內的增殖情況產生影響，因此組織苗生產的供體動物嚴格需要同一品種、統一飼養。

1.5 生產工藝全過程未能達到GMP標準

雖然豬瘟疫苗抗原的部分下游工藝，包括配制、凍干等都在GMP的環境當中進行，但是對兔子進行飼養、接種以及解剖工作要在非GMP的環境當中進行。并且在進行配苗的工序當中不需要在連續性的封閉系統當中進行，需要進行獨立性、分散性的操作，進而使得疫苗的抗原完全暴露或者半暴露在外界環境當中，增加了污染的危險性。

2 豬瘟活疫苗生產工藝的改進方向

2.1 豬瘟疫苗生產抗原定量及效力檢驗方法的改進

有的學者采用進行了原核表達的豬瘟疫苗E2蛋白抗原以及BAIB/c小鼠，通過對CSFV進行單克隆進而建立AC-ELISA的方法，對豬瘟疫苗的臨床組織樣品、細胞的培養物以及攻毒致死的豬病料進行檢測，研究顯示此類方法重復性、特異性以及敏感性都較好。此方法可以在較短時間內迅速準確的將大批量的樣品中的CSFV檢測出來，比病毒分離法以及免疫熒光法優異，其特點是半自動化、自動顯示結果，更加適合在研發機構以及生產機構應用。有的學者進行熒光定量PCR（FQ—PCR）檢測時將構建的質粒做為了標準，此類方法能夠在臨床診斷上應用。當前，在國內外已經建立了應用于豬瘟病毒抗體以及抗原檢測的ELISA技術，多數為抗體檢測技術，大多數在疫苗免疫效果評估以及流行病學黨章應用，在疫苗生產抗原的質量控制當中還未應用。在包被抗體以及檢測抗體的建立當中使用單克隆抗體作為熒光抗體的方法或者是抗原捕捉ELISA，其特點是特異性高，但是敏感性低；使用多克隆抗體敏感性高，特異性低。有的學者采用噬菌體肽庫，在組織樣品當中的豬瘟病毒抗原的檢測以及診斷當中，設立依賴噬菌體擬位競爭性的ELISA方法。競爭性的ELISA優點是高敏感性、高特異性，此類方法在毒素蛋白以及抗原的檢測當中已經得到應用。抗原的準確定量方法可以讓配苗當中的抗原和成品的疫苗有效的抗原量化具有更高的準確性和科學性，能夠使得豬瘟疫苗的效力變得均一穩定，免疫劑量的準確可以讓免疫劑量不足的問題得到避免，同時也可以讓因為免疫劑量過大導致免疫抑制的現象得到避免。

2.2 病毒培養方式的改進及抗原的濃縮純化

采用傳代細胞方式對病毒進行生產可以讓動物組織以及原代細胞帶來的安全風險降到最低甚至可以得到避免，并且含有病毒的培養液當中的病毒含量較高，批次之間的差異較小，穩定性較好。采用ST細胞生物反應器微載體生產豬瘟病毒技術，能夠有效的提高CSFV滴度。此類微載體屬于一種多孔微珠，可以在懸浮細胞的培養物當中添加，細胞就可以馬上在微載體上粘附并生長。因為培養基用量的減少以及細胞培養量的擴大，CSFV滴度得到了顯著提高，而且此類微載體通過處理之后可以循環使用。采用生物反應器自動控制參數，可以讓產品質量更加的穩定、生產工藝更加的先進。當前我國關于豬瘟抗原濃縮純化方面的研究較少，可以采用離心和超濾的方法來進行細胞培養抗原的濃縮純化。有的研究對豬瘟病毒抗原進行純化采用反向親和層析法，將抗原當中殘存的牛睪丸細胞培養物去除，總的蛋白去除率可以高達76.9%；采用進行純化前以及純化后的抗原對豬瘟免疫血清進行檢測，豬瘟免疫血清當中的非相關性抗體反應可以通過純化抗原去除，讓豬瘟免疫抗體檢測的特異性得到有效確保。

[1] 朱良全，彭雋，王棟，等.豬瘟疫苗研究進展及我國傳統疫苗的研究現狀[J].中國獸藥雜志，2005，39（2）：33-37.