淺談微生物濁度法在測定硫酸鏈霉素中的影響因素

趙化芳

(新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站，新疆烏魯木齊 830063)

淺談微生物濁度法在測定硫酸鏈霉素中的影響因素

趙化芳

(新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站，新疆烏魯木齊 830063)

濁度法是在比色皿中按拉丁方排列，加入高低含量的標準品和樣品溶液1ml，再加入含葡萄球菌的液體培養基9ml，通過測定標準品和硫酸鏈霉素的吸光度，計算樣品含量。現將試驗過程中的環境、儀器設備、菌種、培養基、緩沖液、抗生素配置和參數設置等影響因素淺談如下。

濁度法；硫酸鏈霉素；影響因素

1 環境和儀器設備的影響

半無菌室環境，室內照明充足，最好有溫度控制設備，并安裝紫外線消毒燈，操作臺高低要合適。WBS-100微生物比濁法測定儀配備傳熱均勻的專用試管，減少因試管壁傳熱不均造成的光路長度不均的影響；具有升溫快速均勻，溫度精密度高，入射光波長精度高，振搖培養，在線實時檢測等功能。實驗環境和儀器設備是保障試驗成功的前提條件。

2 菌種選擇和菌濃度的影響

2.1 菌種的選擇

實驗用菌種應保持新鮮、純凈，對抗生素反應應靈敏。若菌種不新鮮，其生長速度慢，在規定時間內濁度達不到要求；若菌種不純，各管形成的吸收度精密度差，可信限率高；若菌種對抗生素反應不靈敏，高低劑量抗生素形成的吸收度距離減小，測定結果可信限率顯著增高。本實驗選用對鏈霉素反應靈敏的金黃色葡萄球菌的第三代培養菌，接種到營養瓊脂斜面培養基上，37℃培養24h，用7ml滅菌水將菌苔洗下制成菌懸液，當天使用。

2.2 菌濃度的要求

菌液濃度過高會使濃度-光吸收度不成直線關系，如果菌液濃度過稀，則讀數偏低，誤差增大，在實際測定時一般可控制吸收度讀數在0.3～0.7A較為適宜[1]。

3 培養基pH值和性質的影響

采用液體培養基，無擴散因素的影響，實驗的靈敏度高，結果的精密度和正確率高。硫酸鏈霉素屬于堿性抗生素，抗生素檢定培養基3號，pH為7.0～7.2，含有牛肉膏、酵母提取物，葡萄糖和磷酸鹽等促進細菌快速生長的條件。稱取抗生素檢定培養基3號19.0g加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解后分裝，116℃高壓滅菌30min，滅菌時間不宜過長，滅菌后不得發生沉淀，影響培養基性能。

4 緩沖液的影響

稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水定容至1000ml容量瓶，配制pH值為7.8的緩沖液[1]。分裝于硬質玻璃容器內，應澄明無色，必要時用耐酸過濾漏斗濾除沉淀，121℃高壓滅菌30min后不得有沉淀，影響透光度。

5 抗生素溶液配置和加入的影響

分別精密稱取鏈霉素標準和注射用硫酸鏈霉素適量于容量瓶中，加入適量滅菌水使標準品和樣品溶解完全，定容制成含1000U/ml的溶液；根據試驗菌的靈敏度選擇溶液的劑間比為1：1.5，劑間比過大將導致高低劑量間濁度值距離過大，劑間比過小則相反；根據抗生素濃度濃度范圍，加入pH7.8滅菌緩沖液配置標準品和樣品溶液的最終濃度為6 U/ml和9 U/ml。抗生素濃度過高過低均不能得到正確的實驗結果。

按拉丁方排列加入上述溶液，以抵消培養箱內溫度的差異所引入的誤差。分別在某一標記處沿壁將高低濃度的標準品和樣品溶液各1ml加入到比色皿中，在標記稍上處沿壁加入含菌培養基9ml，將沾在壁上的抗生素充分洗入培養基內，減少濃度誤差。同時制備含菌陽性對照管和無菌培養基空白對照管。整個過程在短時間內完成，減少抗生素與含菌培養基接觸時間不同造成的誤差。

6 培養條件設置的影響

將加入試劑的石英比色皿放入WBS-100微生物比濁法測定儀中，根據實驗要求設置實驗參數：培養溫度為37℃，振搖間隔時間為5min，單次振搖時間為20s，振搖頻率為2HZ，監測間隔時間為10min，監測開始時間為45min停止時間為240min。

培養基的頂端部分為微親氧性，底部為厭氧性，采用間隔一段時間振搖一次的方法，增加氧的供應，促進生長，縮短培養時間，但設置合理的振幅和振搖頻率，避免振搖過程中產生氣泡干擾試驗結果；實時監控生長情況，智能判斷培養終止時間，在線快速讀數，有效減小了因測量時間先后導致的濁度值差異。

經統計，通過濁度法測定效價平行性好，精密度高、可信限率低至3以下，偏離平行符合規定，滿足實驗需要。

7 防止污染

實驗過程中嚴防抗生素、微生物、灰塵和毛發等污染，試驗用比色皿、吸管等應用硫酸-重鉻酸鉀浸泡12h以上，再用蒸餾水和去離子水沖洗干凈，經高壓滅菌后使用，嚴防抗生素殘留和微生物污染。另外在培養基、緩沖液，抗生素配置過程中嚴防空氣中灰塵和自制棉賽毛發污染，影響澄明度和濁度值。

8 小結

濁度法具有靈敏度高，精密度高，測量結果準確、可信限率低、時間短等優點，3～4h內完成監測，當天獲得試驗結果。但濁度法要求高，消除環境設施、儀器設備、試劑材料和參數設置等不利影響因素，防止抗生素、微生物和灰塵毛發等污染。

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].北京：中國農業出版社，2010：附錄，121-128.

[2] 彭素梅，李洪波.濁度法測定四環素效價的可行性研究[J].中國現代藥物應用，2010，4（14）：131-132.

[3] 丁勃，楊娜，謝元超.比濁法測定抗生素效價中常見問題及分析[J].中國藥品標準，2010，11（6）：438-440.

趙化芳（1987—），女，大學本科，助理獸醫師，從事畜牧獸醫和實驗室相關檢測工作。