超高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用進(jìn)展

天津市薊縣藥品檢驗所（301900）霍玉榮

高效液相色譜法是上世紀(jì)六十年代產(chǎn)生的一種現(xiàn)代化分析方法，具有分析速度快、分離效率高等優(yōu)勢，是目前藥物分析領(lǐng)域重要的檢驗手段和分析技術(shù)[1]。超高效液相色譜法是基于高效液相色譜法的基礎(chǔ)上形成的藥物分析新技術(shù)，它由高壓輸液泵、高效固定相、信息化、機(jī)械化以及高靈敏度的檢測機(jī)械構(gòu)成，具有分離速度快、分析效率高，靈敏度高且能反復(fù)測試的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于各種藥物質(zhì)量檢測中。

1 超高效液相色譜法概論

自2 0 世紀(jì)7 0 年代以來，隨著高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)技術(shù)的不斷發(fā)展，美國Waters公司于2004年的匹茲堡會議上推出了最新研制的ACQU ITY超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC)，其采用細(xì)粒徑的新型固定相，可獲得高達(dá)2萬塊/m理論塔板數(shù)的超高柱效，并以系統(tǒng)整體設(shè)計的創(chuàng)新技術(shù)，全面提升了液相色譜的速度、靈敏度和分離度。超高效液相色譜技術(shù)的原理與高效液相色譜技術(shù)相同，都是以范德米特方程作為理論基礎(chǔ)[2]。范德米特方程為：HETP=AdP+B/v+CdP 2v。其中HETP表示理論塔板高度，A表示渦流擴(kuò)散系數(shù)，dP表示填料微粒直徑，B表示分子徑向擴(kuò)散技術(shù)，v表示流動相線速度，C表示傳質(zhì)因子。超高效液相色譜儀優(yōu)點[3]：①1.7μm小顆粒填充因此比高效液相色譜儀具有更好的分離能力。②1.7μm小顆粒提供的柱效比5μm顆粒的柱效提高了3倍。③超高效液相色譜儀采用1.7μm顆粒，比5μm顆粒柱長縮短3倍，柱效不變，結(jié)果分離時間縮短而分離度保持不變。④超高效液相色譜法減小顆粒度，使色譜峰變窄，信噪比增大，靈敏度提高。⑤超高效液相色譜能提高質(zhì)譜離子化效率減小基質(zhì)效應(yīng)。

2 超高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

2.1 用于藥物的含量測定 李京峰等[4]用超高效液相色譜法測定紫杉肽中紫杉醇的含量。紫杉肽注射制劑以蒸餾水溶解，經(jīng)2.0mol/L氫氧化鈉溶液降解處理后，通過對紫杉醇降解產(chǎn)物的測定，間接標(biāo)定紫杉肽注射制劑中紫杉醇mm的含量。采用Agilent SB C18（2.1mm×50mm，1.8μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（10∶90，V/V），流速0.2ml/min，檢測波長240nm參比波長360nm），柱溫40℃（±0.5℃），自動進(jìn)樣器溫度15℃（±0.5℃），進(jìn)樣體積2μl。結(jié)果：紫杉醇濃度在0.31～5.00mg/ml范圍內(nèi)與其降解產(chǎn)物的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.9992，n=5）。不同批次紫杉肽注射制劑中每支含紫杉醇的量在26.77～33.19mg范圍內(nèi)。王宇馳等[5]用超高效液相色譜法測定阿奇霉素分散片的含量，此方法準(zhǔn)確可靠，具有良好的專屬性。陸小云等用超高效液相色譜法同時測定白芍藥中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。

2.2 用于測定藥物的有關(guān)物質(zhì) 王勇躍等用超高效液相色譜-梯度洗脫法檢測注射用阿洛西林鈉的有關(guān)物質(zhì)。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×100mm，1.7mm；流動相A為10mmol/L甲酸銨溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值至6.5)，流動相B為8mmol/L甲酸銨溶液(乙腈/水=200/50)；柱溫為40℃；檢測波長為210nm；流速為0.43mL/min。結(jié)果：阿洛西林鈉主峰與其相關(guān)物質(zhì)峰分離良好，檢出雜質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)多于中國藥典2010年版二部各論方法；在0.3～90μg/ml范圍內(nèi)阿洛西林呈良好的線性關(guān)系(r2=0.9999)，方法的檢測限為0.1μg/ml，重復(fù)性RSD為0.61%(n=6)。薛巧如等UPLC法測定奈韋拉平的有關(guān)物質(zhì)，此法簡便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)。

2.3 測定藥物的血藥濃度 魯靜，陳天朝用超高效液相色譜法測定血清中苯妥英鈉、苯巴比妥和卡馬西平的濃度。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，流動相為乙腈-水（28∶72），流速：0.3ml/min，檢測波長220nm，柱溫20℃。結(jié)果苯妥英鈉、苯巴比妥和卡馬西平的血清濃度分別在2.5～80.0，5.0～160.0，1.0～32.0μg/m l 線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于7.28%，提取回收率為96.18%～103.89%。本方法簡便、快速、準(zhǔn)確。李碧艷用超高效液相色譜法測定環(huán)孢素A的血藥濃度。本法操作簡便，回收率高，精密度好。

2.4 用于體內(nèi)藥代動力學(xué)研究 唐進(jìn)法等用超高效液相色譜法研究大鼠靜脈注射丹紅注射液后丹酚酸B的藥代動力學(xué)行為。方法：大鼠靜脈給予丹紅注射液后，于不同時間點采血，血漿樣品酸化后經(jīng)乙酸乙酯萃取。色譜條件為BEH ShieldRP18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流動相為甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液(29∶10∶61)，體積流量0.3mL/min，檢測波長286nm，柱溫為30℃。結(jié)果：丹酚酸B在0.1705～31.40μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于7.6%，方法回收率90.0%～92.1%。丹酚酸B的t1/2和AUC0-t分別為(1.21±0.69)h和(4.32±1.06)μg·h/ml。丹酚酸B在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)過程符合二室模型。結(jié)論：所建立的測定丹酚酸B血藥濃度的色譜法內(nèi)源性干擾峰少，靈敏度較高。彭平等用超高效液相色譜法，PDA檢測器同時測定大鼠血清中紅景天苷及酪醇的含量。

2.5 用于藥物的代謝產(chǎn)物分析 王子銘、胡志偉等用超高效液相色譜法測定大鼠糞便中的樺木醇。采用Waters BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流動相為乙腈-水(9∶1)，體積流量0.25ml/min，檢測波長為210nm，進(jìn)樣量10μL，運行時間5min。健康大鼠灌胃給藥500mg/kg后，在0～24h、24～48h、48～72h、72～96h時間點收集糞便樣品，測定糞便樣品中樺木醇。結(jié)果：測定數(shù)據(jù)使用分段線性回歸方程計算，在低質(zhì)量濃度1.25～20μg/ml和高質(zhì)量濃度20～320μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r＞0.99)，平均提取回收率≥97%，給藥后96h內(nèi)樺木醇累加排泄量為(47.21±5.07)%。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確。張瑞、劉佳等用UPLC法測定小鼠糞便中的10-羥基喜樹堿。

3 結(jié)語

超高效液相色譜法在藥物分析中顯示出廣闊的應(yīng)用前景和強(qiáng)勁的生命力，它具有超強(qiáng)的分離能力以及超高靈敏度。超高效液相色譜也有一定的缺點。超高效液相色譜儀器造價高影響了超高效液相色譜儀的進(jìn)一步推廣使用；而且超高效液相色譜技術(shù)對色譜柱的要求高，一般廠家很難生產(chǎn);其進(jìn)樣量少又采用半環(huán)方式進(jìn)樣，峰面積重復(fù)性差，填充色譜柱的顆粒細(xì)，色譜柱容易堵塞，這就導(dǎo)致對樣品的要求更高。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，這些問題會得到克服。超高效液相色譜法在藥物分析中將會發(fā)揮越來越重要的作用。